Roles of post-translational modifications in the endocytosis of the BRI1 brassinosteroid receptor
Rôles des modifications post-traductionnelles dans l'internalisation du récepteur des brassinostéroides BRI1
Résumé
Brassinosteroids (BRs) are a class of hormones central to plant development and growth. They are perceived at the cell surface by the plasma membrane-localized receptor kinase BRI1. This perception in turn induces cis- and trans-phosphorylation of the BRI1 receptor and its co-receptor BAK1 leading to the activation of the downstream phosphorylation cascade and activation of transcription factors regulating the expression of many key genes in plant development. In order to ensure controlled growth or to modulate, BRI1 activity and BR signaling are rapidly adjusted in response to biotic or abiotic stresses. In order to regulate the perception of BRs, the receptor kinase BRI1 can be internalized and sent to the vacuole by endocytosis to be degraded. The mechanisms driving the internalization of plasma membrane proteins and receptors are still poorly understood in plants. For BRI1, initial evidence suggested that ubiquitination may be partly responsible for its internalization. Ubiquitination is a post-translational modification involving the attachment of a ubiquitin polypeptide to one or more lysine residues of target proteins. A ubiquitin peptide can also be self-ubiquitinated and thus forms poly-ubiquitination (poly-Ub) chains of different topologies depending on the lysine residue involved in the chain formation. BRI1 can be subjected to poly-Ub with chains using lysine-63 (K63). This type of poly-Ub chains is involved in the internalization of membrane proteins in animals and yeast. In plants, the specific link between K63 poly-Ub and membrane receptor internalization remains to be demonstrated. Numerous studies, using lysine substitution approaches, have indeed shown the role of lysines in internalization. However, these substitutions preventing ubiquitination also prevent other post-translational modifications targeting lysine residues such as SUMOylation, acetylation, or succinylation, preventing to reach robust conclusions. In the first part of my thesis, I investigated deeper the role of poly-Ub K63 in BRI1 endocytosis and BR signaling in a genetic background mutated for the E2 enzymes UBC35 and UBC36 unable to produce poly-Ub chains in K63. By crossing this double mutant with a tagged version of BRI1 to a fluorescent protein, I was able to demonstrate that poly-Ub in K63 is required to initiate BRI1 internalization. Subsequently, I demonstrated the interaction between these E2 enzymes and an E3 ligase, PUB13, already characterized as allowing BRI1 internalization. I was thus able to reveal the mechanism behind the poly-Ub in K63 of BRI1 leading to its internalization. In the second part of my thesis, I participated to the study of BRI1 SUMOylation and showed that it positively modulates the BRs signaling pathway allowing me to propose the hypothesis that SUMOylation stabilizes BRI1 at the plasma membrane. This SUMOylation is removed from BRI1 under elevated temperature conditions, allowing the internalization and degradation of BRI1 in the vacuole. The poly-Ub in K63 is still required for BRI1 internalization under such conditions, suggesting that it is the basal internalization pathway for the BRI1 receptor kinase. In the third part of my thesis, I initiated the development of new techniques to better characterize the regulation of BR1 and that may be control its internalization. To this purpose, I developed a proximity labeling approach, looking for new proteins interacting in a weak or transient manner with BRI1. BRI1 has also been shown to be able to evolve in plasma membrane nanodomains. The latter play an important role in the internalization of membrane proteins and their ability to interact by restricting their movements. I have thus started to develop a super-resolution microscopy approach to study the diffusion of BRI1 within the nanodomains.
Les Brassinostéroides (BRs) sont une classe d'hormones centrale dans le développement et la croissance des plantes. Elles sont perçues à la surface cellulaire par le récepteur kinase BRI1. Cette perception induit la cis- et trans-phosphorylation du récepteur BRI1 et de son corécepteur BAK1. Une cascade de phosphorylation aboutit in fine à l'activation des facteurs de transcription régulant l'expression de gènes clés au développement de la plante. Afin de garantir une croissance contrôlée ou de la moduler rapidement en réponses à des stress biotiques ou abiotiques, la voie de signalisation des BRs est finement régulée. Dans le but de réguler la perception des BRs, le récepteur kinase BRI1 peut être internalisé et envoyé à la vacuole, conséquence d'un trafic cellulaire, où il est dégradé. L'internalisation des récepteurs membranaires est encore un sujet vague chez les plantes. Concernant BRI1, de premières pistes suggèrent que l'ubiquitination pourrait être en partie responsable de son internalisation. L'ubiquitination est une modification post traductionnelle impliquant l'attachement d'un polypeptide d'ubiquitine sur un ou plusieurs résidus lysines des protéines cibles. L'ubiquitine peut également à son tour être ubiquitinée et ainsi former des chaines de poly-ubiquitination (poly-Ub) de différentes topologies en fonction du résidu lysine impliqué dans la formation de la chaine. BRI1 est ainsi sujet à une poly-Ub avec des chaines utilisant la lysine-63 (K63). Ce type de chaines de poly-Ub est impliqué dans l'internalisation et la dégradation des protéines membranaires chez les animaux et les levures. Chez les plantes, le lien spécifique entre la poly-Ub en K63 et l'internalisation des récepteurs membranaire reste à être démontré. De nombreux travaux, par des approches de substitution de lysines, ont montré le rôle des lysines dans l'endocytose. Cependant, ces substitutions en empêchant la fixation d'ubiquitination empêche également d'autres modifications post traductionnelles ciblant la lysine telles que la SUMOylation, l'acétylation, ou la succinylation. Dans la première partie de ma thèse, j'ai étudié la contribution de la poly-Ub en K63 sur la dynamique de BRI1 et l'activation de la voie de signalisation des BRs grâce à l'utilisation d'un fond génétique muté pour les enzymes E2 UBC35 et UBC36 produisant les chaines de poly-Ub en K63. En croisant ce double mutant avec une version de BRI1 étiquetée avec une protéine fluorescente, j'ai pu montrer la nécessité de la poly-Ub en K63 pour initier son internalisation. Par la suite, j'ai démontré l'interaction entre ces E2 enzymes et une E3 ligase, PUB13, déjà caractérisée comme permettant l'internalisation de BRI1. J'ai ainsi pu révéler le mécanisme sous-jacent à la poly-Ub en K63 de BRI1, conduisant à son internalisation. Dans la seconde partie de ma thèse, j'ai participé à des travaux sur la SUMOylation de BRI1 et ai pu montrer que la SUMOylation module positivement la voie de signalisation de BRs permettant d'avancer l'hypothèse que la SUMOylation stabilise BRI1 à la membrane plasmique. Cette SUMOylation est effacée de BRI1 en conditions d'élévation de température, permettant ainsi l'internalisation BRI1. La poly-Ub en K63 reste nécessaire à l'internalisation de BRI1 dans de telles conditions, suggérant qu'elle intervient sur les lysines deSUMOylées pour promouvoir l'endocytose de BRI1. Dans la troisième partie de ma thèse, j'ai initié le développement de nouvelles techniques pour mieux caractériser la régulation de l'internalisation de BRI1. Pour cela, j'ai mis au point une approche de marquage de proximité, recherchant de nouvelles protéines interagissant de manière transitoire avec BRI1. BRI1 a également été montré comme capable d'évoluer dans des nanodomaines jouant un rôle important dans l'internalisation des protéines membranaires. J'ai commencé à développer une approche de microscopie à super-résolution afin d'étudier finement la diffusion de BRI1 au sein des nanodomaines.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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