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Thèse Année : 2023

Study of hepatic ultrastructures by FIB-SEM 3D electron microscopy

Etudes d'ultrastructures hépatiques par microscopie électronique 3D de type FIB-SEM

Yousr Rekik
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1295738
  • IdRef : 272388696

Résumé

The development of volume electron microscopy techniques has revolutionized tissue and cell imaging. In particular, FIB-SEM (focused ion beam scanning electron microscopy) imaging allows to elucidate the three-dimensional ultrastructure of biological structures at a nanometric scale. In the framework of my PhD project, two independent studies were performed using the FIB-SEM approach.In a first study, I worked on silver nanoparticles (AgNP) which are used, for their biocidal function, in everyday products (food packaging, anti-odor clothes...) as well as in medical devices (wound dressings, catheters...). These NP release Ag(I) ions that are responsible for the biocidal effect but are also toxic for mammalian cells. In order to mimic the fate of AgNP in the organism with a focus on their transformations and the excretion of silver species from the liver, we used a 3D model of hepatocyte spheroid which mimics the liver and allows to study biliary excretion. These spheroids were exposed to a silver salt and to two types of AgNP to mimic, respectively, oral and parenteral exposure which are the two main routes of human exposure to these NP. The combination of FIB-SEM technique with other elemental imaging, chemical analysis and speciation techniques allowed us to study the transformations of the different silver species, to visualize their distributions at a subcellular scale, to highlight the storage of silver excess into vacuoles and the biliary excretion of Ag(I) ions and to analyze the impact of silver species on the ultrastructure of hepatocytes, in particular on the mitochondrial network. These results highlight the relevance of our hepatic model to study the transformations of nanomaterials in the liver beyond AgNP.In a second study, I worked on liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) that line the wall of hepatic capillaries or sinusoids. LSEC are highly specialized endothelial cells that have fenestrations or fenestrae allowing for bidirectional exchange between sinusoidal blood and hepatocytes. Studies describing the structure of LSEC are mostly 2D studies that do not allow to fully elucidate the in vivo architecture of these cells and the spatial organization of their fenestrations. The FIB-SEM technique was used to image mouse liver samples focusing on the porosity of sinusoids. A preparation protocol of liver samples that properly preserves the ultrastructure of sinusoids was established. Then, I developed a segmentation method that allowed 3D reconstruction of LSEC at high resolution. The study of the 3D architecture of LSEC and the determination of their fenestrae diameters open new perspectives to further understand the correlation between the function and the structure of these cells under physiological and pathological conditions. Our approach could also help to model the transport of different substances or drugs between blood and hepatocytes and could be used to study the sinusoidal porosity of patients for personalized medicine applications.
Le développement des techniques de microscopie électronique volumique a révolutionné l’imagerie tissulaire et cellulaire. En particulier, la technique FIB-SEM (pour focused ion beam scanning electron microscopy) permet d’élucider l’ultrastructure tridimensionnelle de structures biologiques à une échelle nanométrique. Dans le cadre de ma thèse, deux études indépendantes ont été réalisées en utilisant l’approche FIB-SEM.Dans une première étude, j’ai travaillé sur les nanoparticules d’argent (NP-Ag) qui sont utilisées, pour leur fonction biocide, dans des produits du quotidien (emballages alimentaires, vêtements anti-odeur…) ainsi que dans des dispositifs médicaux (pansements, cathéters...). Les ions Ag(I) relargués de ces NP sont responsables de l’effet biocide mais sont également toxiques pour les cellules de mammifères. Afin de mimer le devenir des NP-Ag dans l’organisme avec un focus sur leurs transformations et l’excrétion d’espèces d’argent du foie, nous avons utilisé un modèle 3D de sphéroïde d’hépatocytes qui mime le foie et permet d’étudier l’excrétion biliaire. Ces sphéroïdes ont été exposés à un sel d’Ag et à deux types de NP-Ag pour mimer, respectivement, le cas d’exposition orale et parentérale qui sont les deux principales voies d’exposition humaine à ces NP. La combinaison de la technique FIB-SEM avec d’autres techniques d’imagerie élémentaire, d’analyse chimique et de spéciation nous a permis d’étudier les transformations des différentes espèces d’Ag, de visualiser leurs distributions à une échelle subcellulaire, de mettre en évidence le stockage de l’excès d’argent dans des vacuoles et l’excrétion biliaire d’ions Ag(I) et d’analyser l’impact des espèces d’argent sur l’ultrastructure des hépatocytes, en particulier sur le réseau mitochondrial. Ces résultats soulignent la pertinence de notre modèle hépatique pour étudier les transformations de nanomatériaux dans le foie au-delà des NP-Ag.Dans une deuxième étude, j’ai travaillé sur les cellules endothéliales sinusoïdales (LSEC) qui tapissent la paroi des capillaires hépatiques ou sinusoïdes. Les LSEC sont des cellules endothéliales hautement spécialisées qui présentent des fenêtres permettant des échanges bidirectionnels entre le sang sinusoïdal et les hépatocytes. Les études décrivant la structure des LSEC sont majoritairement des études en 2D qui ne permettent pas de complètement élucider l’architecture in vivo de ces cellules et l’organisation spatiale de leurs fenêtres. La technique FIB-SEM a été utilisée pour imager des échantillons de foie de souris en se focalisant sur la porosité des sinusoïdes. Un protocole de préparation des échantillons de foie qui préserve bien l’ultrastructure des sinusoïdes a été mis au point. Ensuite, j’ai développé une méthode de segmentation qui a permis de reconstruire en 3D et à haute résolution les LSEC. L’étude de l’architecture 3D des LSEC et la détermination des diamètres de leurs fenêtres ouvrent de nouvelles perspectives pour approfondir la compréhension de la corrélation entre la fonction et la structure de ces cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Notre approche pourrait également aider à modéliser le transport des différentes substances ou médicaments entre le sang et les hépatocytes et pourrait être utilisée pour vérifier la porosité des sinusoïdes de patients dans le cadre d’applications en médecine personnalisée.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04246007 , version 1 (17-10-2023)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04246007 , version 1

Citer

Yousr Rekik. Etudes d'ultrastructures hépatiques par microscopie électronique 3D de type FIB-SEM. Biologie cellulaire. Université Grenoble Alpes [2020-..], 2023. Français. ⟨NNT : 2023GRALV042⟩. ⟨tel-04246007⟩
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