Study of proteins involved in gene regulation and chromatin remodeling during spermiogenesis
Étude des protéines impliquées dans la régulation génique et le remodelage de la chromatine au cours de la spermiogénèse
Résumé
During spermiogenesis, a specific gene expression program ensures the differentiation of spermatids into spermatozoa. This program regulates the flagellum and acrosome formation but also an important chromatin remodelling process that leads to in a high level of chromatin compaction. This process involved the replacement of most of histones by protamine, which are smaller and more basic. The study of gene expression regulation during spermiogenesis helps to understand the molecular mechanisms involved. In mice, the MSYq region, located in the long arm of the Y chromosome, is necessary for this process. Indeed, deletions in this region leads to overexpression of hundreds of genes from the X and Y chromosomes and decreased male fertility resulting from a lot of spermiogenesis defects including abnormal chromatin compaction. It has been shown that Sly, one of the 4 multicopy genes present in the MSYq region, contributes a lot in this phenotype as the SLY deficient males have a similar phenotype, although less sever, to that of mouse with depleted MSYq. Sly possess a homologue on the X chromosome, Slx, which has antagonist function. Among target genes of SLY relevant to explain the abnormal chromatin compaction, Dot1l has been identified. It is highly expressed in spermatids and code for a histone H3K79 methyltransferase. My thesis aimed at answering following questions. Is Sly the only gene involved in the phenotype of males bearing a deletion of MSYq? To answer this question we studied the phenotype of male with MSYq deletion in which SLY expression is rescued in spermatid by a FLAG-SLY transgene. While SLY level is comparable to control males, the phenotype is not rescued showing that another gene included in the MSYq region is involved in the spermiogenesis regulation. The multicopy gene, Ssty is a good candidate. What are the molecular mechanisms involved in spermatid gene expression regulation by Sly and Slx/Slxl1? Our analyses show that SLX/SLXL1 and SLY interact with SSSTY/SPIN proteins which bind to expressed genes via the mark H3K4me3. However only SLY can interact with the repressor complex SMRT/NCOR. Based on our results we conclude that SLY and SLX/SLXL1 regulate the same genes during spermiogenesis, but with opposite effects: Both SLY and SLX/ SLXL1 binds SSTY/SPIN at their targets genes but SLY recruits SMRT/NCOR and reduce the expression of these genes whereas SLX/SLXL1 activate their expression. Sly deficiency leads to the increased recruitment of SLX/SLXL1 at the same target gene, leading to the upregulation of them. A balanced between Sly and Slx/Slxl1 is then necessary to insure the gene expression regulation during spermiogenesis. What is the role of Dot1l during spermiogenesis? To answer, we developed a mouse model DOT1L-KO in which Dot1l is deleted only in the germ line. This model is less fertile than control males and shows morphological and mobility defects in sperm. Also, we observed defect in the chromatin remodelling process leading to an impaired chromatin compaction. A thousand of gene are deregulated in DOT1L-KO spermatids. Among them, genes involved in chromatin regulation, flagellum formation and function but also genes regulating mitochondrial metabolism. We also described for the first time an interaction between DOT1L and the pyruvate dehydrogenase complex. To conclude, our results shows that DOT1L is a spermiogenesis regulator involved in chromatin compaction, flagellum development and function, and metabolism.
Lors de la spermiogenèse, un programme génétique unique assure la différenciation des spermatides en spermatozoïdes. Il contrôle la formation du flagelle et de l'acrosome, ainsi qu'une réorganisation majeure de la chromatine aboutissant à un très haut niveau de compaction. Dans cette réorganisation la majorité des histones est remplacée par des protamines, plus petites et plus basiques. L'étude de la régulation de l'expression génique lors de la spermiogenèse permet de mieux comprendre les mécanismes en jeu. Chez la souris, la région MSYq, localisée sur le bras long du chromosome Y, est nécessaire à ce processus. Des délétions dans cette région provoquent, en effet, une surexpression de centaines de gènes de l'X et l'Y, ainsi qu'une infertilité masculine résultant de multiples défauts de la spermiogenèse, notamment une altération de la compaction de la chromatine. Il a été montré que Sly, l'un des 4 gènes multicopies portés par la région MSYq, y contribue de façon majeure puisque les souris mâles déficients en Sly ont un phénotype similaire, bien que moins sévère, à celui des mâles sans la région MSYq. Sly possède un homologue porté par le chromosome X : Slx/Slxl1 dont la fonction est antagoniste. Parmi les gènes cibles de SLY pertinents quant au phénotype d'anomalies de remodelage de la chromatine a été identifié le gène Dot1l qui est fortement exprimé dans les spermatides et code pour l'histone H3K79 méthyltransférase. Lors de ma thèse, j'ai cherché à répondre aux questions suivantes. Sly est-il le seul gène impliqué dans le phénotype des mâles portant des délétions de MSYq ? Pour y répondre, nous avons phénotypé des mâles avec délétions de MSYq dans lesquels l'expression de SLY a été rétablie dans les spermatides par l'introduction d'un transgène FLAG-SLY. Le phénotype n'est pas restauré malgré un niveau d'expression de SLY comparable à celui des souris contrôles indiquant qu'un autre gène de la région MSYq, potentiellement le gène multicopie Ssty, est impliqué dans la régulation de la spermiogenèse. Par quels mécanismes moléculaires Sly et Slx/Slxl1 régulent-ils l'expression génique des spermatides ? Nos analyses montrent que SLX/SLXL1 et SLY interagissent avec les protéines SSTY/SPIN qui se fixent au niveau des gènes exprimés via la marque H3K4me3. En revanche, seul SLY se lie au complexe répresseur SMRT/NCOR. Nos résultats permettent de conclure que SLY et SLX/SLXL1 régulent l'expression des mêmes gènes lors de la spermiogenèse, mais de façon antagoniste : SLY et SLX/SLXL1 interagissent avec SSTY/SPIN au niveau de ces gènes mais SLY recrute SMRT/NCOR et ainsi réduit l'expression de ces gènes alors que SLX/SLXL1 l'active. En cas de déficience en Sly, plus de protéines SLX/SLXL1 sont recrutées aux mêmes gènes cibles, ce qui entraine leur surexpression. Un équilibre entre Sly et Slx/Slxl1 est donc nécessaire pour assurer la régulation génique lors de la spermiogenèse. Quel est le rôle de Dot1l dans la spermiogenèse ? Afin d'y répondre nous avons créé un modèle murin, DOT1L-KO, délété pour Dot1l dans la lignée germinale uniquement. Ce modèle est hypofertile et présente des défauts de morphologie et de mobilité des spermatozoïdes ainsi que des anomalies de remodelage induisant une compaction incomplète de la chromatine. L'expression d'environ 1000 gènes est dérégulée dans les spermatides DOT1L-KO, parmi lesquels des gènes impliqués dans la régulation de la chromatine, des gènes assurant l'intégrité et la mobilité du flagelle ainsi que des gènes régulant le métabolisme mitochondrial. Nous décrivons également pour la première fois une interaction entre DOT1L et le complexe pyruvate déshydrogénase. En conclusion, ces résultats montrent que DOT1L est un régulateur de la spermiogenèse impliqué à la fois dans la compaction de la chromatine, la formation et le fonctionnement du flagelle, et le métabolisme.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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