Effect of paromomycin on the development of the parasite Cryptosporidium parvum : from standard methods of detection to impedance spectroscopy, how to accelerate drug screening method ?
Effet de la paromomycine sur le développement du parasite Cryptosporidium parvum : des méthodes standards de détection à la spectroscopie d'impédance, comment accélérer les méthodes de criblage des molécules à visée thérapeutique ?
Résumé
Cryptosporidium is a protozoan parasite which infects a wide range of hosts including Human Beings and has a global presence. Cryptosporidium is the etiologic agent of cryptosporidiosis, a disease characterized by profuse diarrhea. In vulnerable patients (infants, old people or immunodeficient persons) the prevalence and severity of infection increases and can provoke to death. In Africa and Asia, Cryptosporidium was identified as the second cause of diarrhea in children under 2 years old. To date, no vaccine nor drug therapy is available yet. Research for new drugs against Cryptosporidium therapy encountered difficulties due to the absence of standardized and automated tools enabling the study of the complete Cryptosporidium Life cycle and drug screening.Therefore, this project aims to develop a microsystem based on impedance spectroscopy for the study of Cryptosporidium parvum and drugs screening. In this context, the efficacy of paromomycin (the gold standard used in drugs screening against C. parvum) was determined by standard methods (molecular and microscopic) to be compared with impedance spectroscopy.Here, Human ileocecal colorectal adenocarcinoma cells (HCT-8) were grown to confluency and infected by C. parvum during 48 h with a range of paromomycin concentrations. Results were obtained by fluorescence microscopy and molecular method (real-time qPCR). The level of infection was assessed using fluorescent images combined with an automatic detection of parasites using a Fiji plugin (StarDist) and morphometric data for each parasite were recorded. The half maximal inhibitory concentrations (CI50) of paromomycin were obtained by both methods (357ug/mL and 382ug/mL respectively). Thus, the new approach using the electrical impedance-based device to quantify infectivity of HCT-8 infected by C. parvum showed a characteristic response of infected cells from 12 hours of infection, which could be used as an infectivity sensor, faster than current methods and could be represents a suitable method for drug screening.
Les parasites du genre Cryptosporidium sont les agents pathogènes responsables d'une maladie gastro-entérique marquée par des diarrhées sévères : la cryptosporidiose. Cette infection peut devenir fatale chez les individus les plus fragiles (enfants en bas âge, personnes âgées ou immunodéprimées). Ainsi, bien que présente dans le monde entier indépendamment du niveau de développement économique des pays, la cryptosporidiose a été décrite comme étant la deuxième cause de diarrhée sévère pouvant entraîner la mort chez les enfants âgés de moins de 2 ans en Afrique et en Asie. A ce jour, aucun vaccin ni traitement n'a été mis au point de manière efficace. La recherche de nouvelles molécules thérapeutiques s'est heurtée à l'absence d'outils standardisés et automatisés, limitant l'étude du parasite et la découverte de nouvelles molécules.Le projet de cette thèse vise donc à développer un microsystème basé sur la spectroscopie d'impédance dédié à l'étude du parasite Cryptosporidium parvum et au criblage de molécules thérapeutiques. Dans ce contexte, l'efficacité de la paromomycine (molécule de référence utilisée dans le criblage in vitro de molécules contre C. parvum) a été déterminée par des méthodes standards (moléculaire et microscopique) afin d'être comparée à la spectroscopie d'impédance.Pour cela, les cellules HCT-8 issues d'un adénocarcinome iléo-caecal humain ont été infectées par C. parvum pendant 48 heures et traitées avec une gamme de concentrations croissantes en paromomycine. L'efficacité de la paromomycine a d'abord été déterminée par la technique de microscopie puis par la méthode moléculaire (qPCR). La quantification du parasite sur les images microscopiques fluorescentes a été réalisée automatiquement en utilisant le plugin StarDist (Fiji) et des données morphométriques sur chaque parasite ont été obtenues. De même, les Concentrations Inhibitrices médianes de la paromomycine (CI50) ont été obtenues par ces deux méthodes avec des valeurs de 357µg/mL et 382µg/mL respectivement. L'analyse par spectroscopie d'impédance a permis d'obtenir une réponse caractéristique des cellules infectées dès 12 heures d'infection qui pourrait être utilisée comme un capteur d'infectivité et représenter une méthode adaptée au criblage de molécules thérapeutiques.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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