New modes of regulation of ARPP19 illuminate the resumption of oocyte meiosis : a cross study in jellyfish and amphibian
De nouveaux modes de régulation d’ARPP19 éclairent la reprise de la méiose de l’ovocyte : une étude croisée chez la méduse et l'amphibien
Résumé
My thesis focused on the role of ARPP19, a protein at the center of meiosis resumption in oocytes. In all animals, oocyte meiosis is interrupted during prophase I. This long pause is used by the oocyte to accumulate nutritive and informative molecules that will serve during embryogenesis. The prophase arrest is due to an inactive form of MPF (M-phase Promoting Factor). This complex, made up of the Cdk1 kinase and Cyclin B, is the driving force behind eukaryotic cell division. In vertebrates, high levels of cAMP-dependent protein kinase (PKA) activity prevent MPF activation, keeping the oocyte blocked in prophase. A hormonal stimulus releases the prophase arrest and promotes meiosis resumption. In vertebrates, one of the first events induced by this stimulation is the inactivation of PKA, triggering a signaling pathway leading to MPF activation. My thesis focused on the mechanisms by which PKA controls MPF. In Xenopus, one of PKA key substrates is ARPP19, phosphorylated by PKA on serine 109 (S109). Following inactivation of PKA by the hormonal stimulation, ARPP19 is dephosphorylated by the PP2A-B55 phosphatase, indirectly enabling MPF activation. When MPF activates, ARPP19 undertakes another function. MPF activates the Greatwall kinase (Gwl), which phosphorylates ARPP19 on serine 67 (S67), converting it into an inhibitor of PP2A-B55. This inhibition is essential for division, as this phosphatase opposes MPF by dephosphorylating its substrates. The negative control exerted by PKA on MPF is not conserved in all metazoans. Many non-vertebrate species show an inverted mechanism: the release of the prophase block does not depend on PKA inactivation, but on its activation, as in the jellyfish Clytia hemisphaerica. ARPP19 is expressed in the oocytes of this species. The protein should therefore be phosphorylated by PKA in the Clytia oocyte. Why does it not block MPF activation? I have shown that Clytia ARPP19 (ClyARPP19) has a PKA phosphorylation site. However, ClyARPP19 is a poor substrate of PKA and is not phosphorylated by this kinase in the oocyte. Moreover, the mechanisms by which it inhibits MPF are not functional in Clytia. This double security level therefore protects Clytia oocyte from MPF inhibition by ARPP19. My results provide an evolutionary scenario for the negative control exerted by PKA on the resumption of meiosis in vertebrates. Unlike the control of ARPP19 by Gwl, conserved in all eukaryotes, the phosphorylation site of ARPP19 by PKA appears in metazoans, where it is conserved. But it is used as a regulator of meiosis resumption only in vertebrates, thanks to an increase of its phosphorylation potential by PKA. I then investigated the mechanisms by which the phosphorylated form of ARPP19 on S109 inhibits MPF. I discovered that in prophase, ARPP19 is weakly phosphorylated on S67 by a basal Gwl activity. Limiting this phosphorylation is critical to prevent spontaneous resumption of meiosis. I have shown that two types of regulation limit this phosphorylation by Gwl. The first is S109 phosphorylation by PKA, the second is an intramolecular regulation based on two domains in the C-terminal part of ARPP19. My work leads to a new vision of the prophase arrest, a metastable state in which ARPP19 is phosphorylated on both S109 (major) and S67 (minor). They provide insight into one negative role of PKA-phosphorylated ARPP19 on MPF activation: preventing phosphorylation by Gwl. Dephosphorylation of S109 in response to the hormone generates an ARPP19 protein accessible to Gwl, one of the key elements required for MPF activation.
Ma thèse a porté sur le rôle d’ARPP19, une protéine qui est au cœur du mécanisme de reprise de la méiose des ovocytes. Chez tous les animaux, la méiose des ovocytes s’interrompt en prophase I. Ce long arrêt est mis à profit par l’ovocyte qui accumule des molécules nutritives et informatives utilisées lors de l’embryogenèse. L’arrêt en prophase est dû au maintien sous une forme inactive du MPF (M-phase Promoting Factor). Ce complexe, formé de la kinase Cdk1 et de la Cycline B, est le moteur de la division des cellules eucaryotes. Chez les vertébrés, une activité élevée de la kinase PKA (Protéine Kinase dépendant de l’AMPc) empêche l’activation du MPF, ce qui maintient le blocage en prophase de l’ovocyte. Un stimulus hormonal provoque la levée de ce blocage et la reprise de la méiose. Chez les vertébrés, l’un des premiers évènements induits par cette stimulation est l’inactivation de PKA, ce qui enclenche une voie de signalisation aboutissant à l’activation du MPF. Ma thèse a porté sur les mécanismes permettant à PKA de contrôler le MPF. Chez le Xénope, l’un des substrats-clés de PKA est ARPP19, phosphorylée par PKA sur la sérine 109 (S109). Suite à l’inactivation de PKA par la stimulation hormonale, ARPP19 est déphosphorylé par la phosphatase PP2A-B55 et permet indirectement l’activation du MPF. Au moment où le MPF s’active, ARPP19 remplit une autre fonction. Le MPF active la kinase Greatwall (Gwl) qui phosphoryle ARPP19 sur la sérine 67 (S67), le convertissant en un inhibiteur de PP2A-B55. Cette inhibition est essentielle pour la division car cette phosphatase s’oppose au MPF en déphosphorylant ses substrats. Le contrôle négatif exercé par PKA sur le MPF n’est pas conservé chez tous les métazoaires. De nombreuses espèces non-vertébrées présentent un mécanisme inversé : la levée du blocage en prophase ne dépend pas d’une inactivation, mais d’une activation de PKA, comme chez la méduse Clytia hemisphaerica. Or, ARPP19 est exprimé dans les ovocytes de cette espèce. La protéine devrait donc être phosphorylée par PKA dans l’ovocyte de Clytia. Comment ne bloque-t-elle pas l’activation du MPF? J’ai montré qu’ARPP19 de Clytia (ClyARPP19) possédait un site de phosphorylation par PKA. Néanmoins, ClyARPP19 est un mauvais substrat de PKA et n’est pas phosphorylé par cette kinase dans l’ovocyte. En outre, les mécanismes par lesquels il inhibe le MPF ne sont pas fonctionnels chez Clytia. Une double sécurité protège donc l’ovocyte de Clytia d’une inhibition du MPF par ARPP19. Mes résultats permettent d’établir un scénario évolutif quant au contrôle négatif exercé par PKA sur la reprise de la méiose chez les vertébrés. Contrairement au contrôle d’ARPP19 par Gwl, retrouvé chez tous les eucaryotes, le site de phosphorylation d’ARPP19 par PKA apparaît chez les métazoaires, chez qui il est conservé. Mais il n’est utilisé comme régulateur de la reprise de la méiose que chez les vertébrés, grâce à un accroissement de son potentiel de phosphorylation par PKA. J’ai ensuite étudié les mécanismes permettant à la forme phosphorylée sur S109 d’ARPP19 d’inhiber le MPF. J’ai découvert qu’en prophase, ARPP19 est faiblement phosphorylé sur la S67 par une activité basale de Gwl. Or, il est critique de limiter cette phosphorylation pour éviter une reprise spontanée de la méiose. J’ai montré que deux types de régulation limitaient cette phosphorylation. Le premier est la phosphorylation de la S109 par PKA, le second est une régulation intramoléculaire reposant sur deux domaines de la partie C-terminale d’ARPP19. Mes travaux conduisent à une nouvelle vision de l’arrêt en prophase, un état métastable où ARPP19 est à la fois phosphorylé sur S109 (majeure) et S67 (mineure). Ils permettent de dégager un rôle négatif de la phosphorylation d’ARPP19 par PKA sur l’activation du MPF : empêcher la phosphorylation par Gwl. La déphosphorylation de la S109 en réponse à l’hormone génère une protéine ARPP19 accessible à Gwl, l’un des éléments nécessaires à l’activation du MPF.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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