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Thèse Année : 2023

Mechanisms of Extracellular Vesicle Cargo Delivery

Mécanismes de livraison de la cargaison des vésicules extracellulaires

Shaghayegh Askarian Amiri
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1346035
  • IdRef : 274158671

Résumé

Extracellular vesicles (EVs) are recognized to play an important role in physiological and pathological intercellular communication processes. EVs carry lipids, proteins, and microRNAs. which can be shuttled between cells, thereby allowing intercellular communications. The transfer of biologically active EVs cargoes into receiving cells begins with endocytosis of the EVs which are thought to fuse with the endosomal membrane. This is analogous to the content delivery of some enveloped viruses which requires their fusion with the endosomal membrane in a way dependent on acidic pH and the protein Alix.The aim of our work is to characterize the molecular mechanisms driving the fusion of EVs with target membranes of cells or liposomes. For this, we used luciferase complementation assay to follow the fusion of EVs to membranes of receiving cells and fluorescence membrane-mixing assay to quantify EV membrane fusion to liposomes. We also intend to test if alike viruses, Alix is required for fusion of EVs with endosomal membranes.For this, we used recipient cells expressing LgBit, an inactive subunit of nanoluciferase that activates upon binding to a small peptide, HiBit was fused to the EV cargo proteins and luminescence should only be emitted once HiBit is delivered to the cytoplasm of LgBit recipient cells. We could demonstrate the interaction of HiBit-containing EVs with LgBit-receiving cells but no increase in luminescence, suggesting that no fusion occurs. While in the presence of VSV-G protein, luminescence was enhanced, showing that our method is capable of detecting fusion of EVs to membranes of receiving cells. Importantly, the presence of Alix in recipient cells did not seem to be crucial for this fusion, as it also occurred in Alix ko cells.However, using fluorescence membrane-mixing assay, our results demonstrated the fusion of stained EVs with unlabeled liposomes in the presence of recombinant Alix at low pH, simulating the acidic conditions found in endosomes.Finally, we examined how Alix is associated with EVs, as the protein had been reported to be both cytosolic and extracellular suggesting that it can cross membranes. In summary, my thesis work tends to show that EV have the capacity to fuse with membrane in an Alix-dependent process invitro. However, we were unable to establish the role of Alix in EV fusion with endosomal membrane in vivo.
Les vésicules extracellulaires (VE) sont reconnues pour jouer un rôle important dans les processus de communication intercellulaire physiologiques et pathologiques. Les VE transportent des lipides, des protéines et des microARN, qui peuvent être transférés entre les cellules, permettant ainsi les communications intercellulaires. Le transfert de cargaisons de VE biologiquement actives dans les cellules réceptrices commence par l'endocytose des VE, qui fusionneraient avec la membrane endosomale. Ceci est analogue au transfert de contenu de certains virus enveloppés qui nécessite leur fusion avec la membrane endosomale d'une manière qui dépend du pH acide et de la protéine Alix.Le but de notre travail est de caractériser les mécanismes moléculaires à l'origine de la fusion des VE avec les membranes cibles des cellules ou des liposomes. Pour ce faire, nous avons utilisé le test de complémentation de la luciférase pour suivre la fusion des VE avec les membranes des cellules réceptrices ainsi que des tests de transfert de fluorescence pour quantifier la fusion des membranes des VE avec les liposomes. Nous avons testé si, à l'instar des virus, Alix est nécessaire à la fusion des VE avec les membranes endosomales.Pour ce faire, nous avons utilisé des cellules réceptrices exprimant LgBit, une sous-unité inactive de la nanoluciférase qui s'active en se liant à un petit peptide appelé HiBit. HiBit a été fusionné aux protéines cargo des EV et la luminescence mesurée qui ne devrait être émise qu'une fois HiBit délivré dans le cytoplasme des cellules réceptrices de LgBit. Nous avons pu démontrer l'interaction des EVs contenant HiBit avec les cellules réceptrices de LgBit mais aucune augmentation de la luminescence suggérant la fusion. En revanche, en présence de la protéine de fusion VSV-G, la luminescence a augmenté, ce qui montre que notre méthode est capable de détecter la fusion des EV avec les membranes des cellules réceptrices. Il est important de noter que la présence d'Alix dans les cellules réceptrices ne semble pas être cruciale pour cette fusion, puisqu'elle se produit également dans les cellules Alix ko. Cependant, en utilisant un essai in vitro nous avons démontré la fusion d’EVs avec des liposomes en présence d'Alix recombinant à faible pH, simulant les conditions acides retrouvées dans les endosomes. Enfin, nous avons examiné comment Alix est associé aux EVs, car la protéine a été signalée comme étant à la fois cytosolique et extracellulaire, ce qui suggère qu'elle peut traverser les membranes. En résumé, mon travail de thèse tend à montrer qu’in vitro les EV ont la capacité de fusionner avec la membrane dans un processus dépendant d'Alix. Cependant, nous n'avons pas pu établir le rôle d'Alix dans la fusion des EV avec la membrane endosomale in vivo.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04433700 , version 1 (02-02-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04433700 , version 1

Citer

Shaghayegh Askarian Amiri. Mechanisms of Extracellular Vesicle Cargo Delivery. Structural Biology [q-bio.BM]. Université Grenoble Alpes [2020-..]; Institut de biologie structurale (Grenoble), 2023. English. ⟨NNT : 2023GRALV053⟩. ⟨tel-04433700⟩
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