Adaptive optics integration in lattice light-sheet microscope for depth super-resolution imaging
Intégration de l'optique adaptative sur un microscope à feuille de lumière 'lattice' pour l'imagerie super-résolue en profondeur
Résumé
Fluorescence microscopy has become an indispensable tool for biological studies, allowingobservation of structures of interest. Used on both fixed or living samples, it provides greatspecificity and high-contrast. Among these techniques, the optical sectioning offered bylight-sheet microscopy (LSFM or SPIM) is a game-changer. It maximises image contrastwhilst avoiding too rapid fluorescence loss of the samples. Lattice light-sheet microscopy(LLSM) improves these characteristics by using a thinner light-sheet over a larger field ofview. As a result, it offers the possibility of fluorescence imaging inside thick samples downto around 30 μm. In addition, it allows with very high spatial and temporal resolutionwhilst almost obliviating phototoxicity.As other microscopy techniques, it suffers from two drawbacks, both linked to the natureof the light, impairing the image’s quality. (1) Multiple interfaces and the inhomogeneityof samples induce optical aberrations that increase with imaging depth. Hence, disruptionof the wavefront highly impairs the final resolution of the image. (2) The diffraction limitconstrains the resolution to a minimum of ~200 nm and therefore prevents the observationof structures smaller than this limit.As a workaround to these phenomena, we decided to implement two methods on theLLSM: (1) adaptive optics to minimise optical aberrations in the depth of thick samplesand (2) super-resolution microscopy using a single molecule localisation microscopy(SMLM) technique, called DNA-PAINT, to achieve nanometric resolutions. Our method,called AIO, is based on the images recorded by the camera, through refocusing of the lightsheet (AF) and correction in response to indirect measurement of the wavefront, called(3N+).This thesis presents the original design of the method, and the optimization of itsparameters. AIO improves the resolution and contrast of diffraction-limited and SMLMresolution images. (1) In "classical" resolution, the AIO enables a plane wavefront to berecovered with an error of less than 50 nm RMS and in less than 40 seconds. Correctingaberrations also optimises the deconvolution process by restoring the system's PSF. Thisgain is illustrated by the imaging of dendritic spines at 40 μm below the surface oforganotypic brain slices and the acquisition of the second cell layer of Arabidopsis roots.(2) In super-resolution, we demonstrated the application of a DNA-PAINT protocol downto ~50 μm below the surface of brain slices and the value of adaptive optics for improvingdetection density and localisation accuracy in SMLM reconstruction.
La microscopie de fluorescence est devenue un outil indispensable pour les étudesbiologiques en permettant d’observer des structures d’intérêts de manière spécifique etcontrastée au sein d’échantillons fixés ou vivant. Parmi ces techniques, le sectionnementoptique offert par la microscopie à feuille de lumière jouit d’un grand avantage enminimisant le bruit de fond et en réduisant phototoxicité/photoblanchiment. Lamicroscopie à feuille de lumière « lattice » (LLSM) maximise ses caractéristiques enutilisant une feuille de lumière, d’épaisseur constante sur un plus grand champ de vue.Ainsi, elle offre la possibilité d'imager la fluorescence à l'intérieur d’échantillons épaisjusqu’à environ 30 μm, avec une très grande résolution spatiale, temporelle et une trèsfaible phototoxicité.Toutefois, comme d’autres techniques de microscopie, elle souffre de deux problématiquesliées à la nature de la lumière, qui dégradent la qualité des images acquises. (1) Lesaberrations optiques, induites par les interfaces et l’inhomogénéité des échantillons,croissantes avec la profondeur d’imagerie, perturbent le front d’onde et donc la résolutionfinale de l’image. (2) La limite de diffraction contraint la résolution à ~200 nm minimumet empêche donc l’observation de structures de taille inférieure à cette limite.Pour contrer ces phénomènes, nous avons décidé de combiner la LLSM avec deuxméthodes complémentaires : (1) l’optique adaptative pour minimiser les aberrationsoptiques en profondeur d’échantillons épais et (2) la microscopie à super-résolution àtravers une technique de microscopie par localisation de molécules uniques (SMLM),nommée DNA-PAINT, pour atteindre des résolutions nanométriques. Plusparticulièrement, notre méthode, nommée AIO, s’appuie sur les images enregistrées parla caméra, à travers : une refocalisation de la feuille de lumière (AF) et une correction parmesure indirecte du front d’onde, nommée (3N+).Cette méthode, dont le paramétrage a été étudié au cours de cette thèse, améliore larésolution et le contraste des images en résolution limitée par diffraction et en SMLM. (1)En résolution « classique », l’AIO permet de récupérer un front d’onde plan avec une erreurinférieure à 50 nm RMS et en moins de 40 secondes. La correction des aberrations optimiseégalement le processus de déconvolution en restaurant la PSF du système. Ce gain estillustré à travers l’imagerie d’épines dendritiques à 40 μm sous la surface de tranche decerveaux organotypiques et l’acquisition de structures sub-micrométrique dans ladeuxième couche cellulaire de racines d’Arabidopsis. (2) En super-résolution, nous avonsdémontré l’application d’un protocole DNA-PAINT jusqu’à ~50 μm sous la surface detranches de cerveaux et l’intérêt de l’optique adaptative pour améliorer la densité dedétection et la précision de localisation en reconstruction SMLM.
Domaines
Physique [physics]| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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