Les glycosaminoglycanes (GAGs) sont des polymères linéaires constitués d’une répétition d’unités disaccharidiques (diGAGs) présentant une forme hétérogénéité. Ils sont impliqués dans un grand nombre de processus biologiques, tels que la différentiation cellulaire et la cancérisation, où ils peuvent faire office de bio-marqueurs spécifiques de ces états physiologiques. Certaines bactéries synthétisent des GAGs. Par exemple, E. coli K5 produit de l’héparosan, un GAG non immunogène et biocompatible contre lequel la production d'anticorps est difficile. Par conséquent, les réactifs reconnaissant spécifiquement l'héparosane sont limités.Dans cette thèse, nous décrivons d’une partle développement d’outils de détection de l’héparosan et autres GAGs dans des extraits biologiques; et d’autre part une étude de la biosynthèse bactérienne de l’héparosan.Le développement d'outils analytiques a commencé par l'ingénierie de la protéine tailspike spécifique à l'héparosane (KflB). A l’aide d’une approche de mutagénèse dirigée basée sur une analyse structurale, l’activité enzymatique de KflB est neutralisée tout en conservant ses propriétés de fixation à l’héparosan (lectine artificielle). Afin de caractériser le mécanisme catalytique de KflB, deux approches basées sur l’analyse HPLC sont mises en œuvre: (i) la digestion de l’héparosan par KflB et la détection des produits de dégradation à λ = 250 nm; (ii) Des nonamères d’héparosan marqués à la fluorescence (chapitre 2) sont utilisés comme substrats de KflB. Nos résultats montrent que KflB est une lyase qui génère une double liaison au niveau des résidus glucuronyles. Cette activité est de nature endolytique et processive. Un domaine C-terminal chaperone (CTD) est nécessaire au repliement correct de l’enzyme; celui-ci est détaché de façon autolytique pour libérer l’enzyme mature. Par alignement avec la protéine homologue KflA et mutagénèse dirigée, les acides aminés F202 et E204 sont identifiés comme essentiels à la catalyse. Un mutant alanine au niveau de ces positions se révèle inactif mais garde ses propriétés de liaison ce qui en fait un agent de détection de l’héparosan.Ensuite (chapitre 3), nous développons une technique d’analyse applicable aux GAGs en général. Pour cela, nous adaptons une analyse multiplexe en gel d’électrophorèse capillaire avec détection de fluorescence laser (xCGE-LIF).Ceci nécessite la construction d’une bibliothèque de référence basée sur les temps de rétention, réalisée à partir de diGAGs commerciaux marqués à l’AMAC et analysés par xCGE-LIF. Nous montrons que les isomères diGAGs peuvent être détectés avec une grande fiabilité et sensibilité. Afin d’analyser les GAGs dans des extraits biologiques, nous utilisons des lyases spécifiques afin de générer des diGAGs, marqués à l’AMAC puis analysés en comparaison des différents standards. Nous appliquons ensuite cet étalonnage à l’étude des variations de la composition en GAGs au cours de la différentiation cellulaire. Les résultats préliminaires obtenus avec des hESCs indiquent que la composition en diGAGs est altérée. Il s’en dégage que notre protocole d’analyse s’avère particulièrement intéressant comme outil d’analyse des GAGs.Le cluster des gènes de capsule d’E. coli K5 est composé de kfiA-D. Alors que KfiAC sont des synthases confirmées, le rôle de KfiB est méconnu. A partir d’une analyse des banques de données, nous identifions une série d’isoformes de KfiB qui diffèrent au niveau d’une séquence répétée, ce qui constitue la base du chapitre 4. Afin d’explorer l’importance de ce motif, nous entreprenons la génération des isoformes contenant un, deux, et quatre motifs (KfiB1r, KfiB2r et KfiB4r). Les gènes de synthèse sont exprimés dans E. coli BL21-kfiCAD et nous avons évalué leur impact sur la synthèse et la distribution de l'héparosane. Bien qu'une tendance vers des chaînes plus longues était visible si KfiB1r et KfiB4r étaient co-exprimés, l'impact de KfiB n'a pu être déterminé que partiellement.