Structural and functional characterization of oncogenic mutations in histone methyltransferase SETD2 and histone acetyltransferase MOZ
Caractérisation structurale et fonctionnelle de mutations oncogéniques de l'histone méthyltransférase SETD2 et de l'histone acétyltransférase MOZ
Résumé
SET Domain containing 2 (SETD2) is the major human histone methyltransferase responsible for the trimethylation of lysine 36 of histone H3 (H3K36) and the deposition of the epigenetic mark H3K36me3. This enzyme is a member of the SET domain histone methyltransferases family and catalyzes the transfer of a methyl group onto the target lysine using the cofactor S-adenosylmethionine (SAM). The H3K36me3 epigenetic mark is involved in several cellular processes including transcription regulation and DNA repair. SETD2 is described as one of the most frequently mutated tumor suppressors in cancer (clear cell renal cell carcinomas and leukemias). Despite the importance of this enzyme, the characterization of these mutations remain poorly documented. The aim of this thesis was to characterize structurally and functionally the SETD2 L1609P mutation by molecular and cellular biochemistry and crystallography approaches. This mutation was identified in relapsed leukemia patients after chemotherapy. We were able to obtain the crystallographic structure of the SETD2 L1609P mutant at 2.2 Å. Our structure reveals that the mutation leads to conformational changes at the active site of the enzyme. This observation is in agreement with our activity assays data showing that the mutant is only slightly active on purified histone H3 or on nucleosomes (25% residual activity). The use of HEK293 cells modified by CRISPR/Cas9 approach to express the SETD2 L1609P mutant confirms the impact of the mutation on the activity of the enzyme which results in a significant decrease of the H3K36me3 mark in cells. We have also shown that the L1609P mutant is poorly expressed due to the formation of ubiquitinated nuclear aggregates (puncta) degraded by the proteasome. Our work also confirms that the L1609P mutation of SETD2 confers resistance to apoptosis following etoposide treatment of cells. This study provides the molecular and structural basis for the understanding of the impact of an oncogenic SETD2 mutation acquired after relapse. In parallel to this work, we also studied the structural and functional effect of an oncogenic mutation of the histone acetyltransferase MOZ (MOnocytic leukemia Zing finger). This enzyme is a member of the MYST domain family of lysine acetyltransferases and its substrates are the H3 histone (notably H3K23) and non-histone proteins such as p53. Genetic alterations of MOZ (mutations or genomic translocations) are implicated in haematological malignancies and other types of cancers. However, the molecular and functional impact of these alterations remains poorly documented. Our study focused on the T605P mutation identified in colorectal cancers. This mutation is located in the catalytic domain of the enzyme in juxtaposition with the lysine 604 (K604) which auto-acetylation is known to be important for enzymatic activity. Using protein biochemistry and enzymology approaches, we showed that the MOZ T605P mutant was unable to acetylate histone H3 and p53 protein but retained its ability to self-acetylate. Analysis of CRISPR/Cas9-modified HEK293 cells expressing the MOZ T605P mutant confirmed the loss of activity of the enzyme and the concomitant decrease in the epigenetic mark H3K23ac. Furthermore, we solved the crystallographic structure of MOZ T605P at 2.9 Å and showed that the mutation causes a conformational change of the active site leading to a steric clash that may alter binding of the target lysine. The structure of the MOZ T605P mutant also confirms its ability to self-acetylate on lysine 604. This work provides a description at the molecular and functional impact of an oncogenic mutation of MOZ and a better understanding of the catalytic machinery of this enzyme.
Chez l'Homme, SET Domain containing 2 (SETD2) est la principale histone méthyltransférase responsable de la triméthylation de la lysine 36 de l'histone H3 (H3K36) pour donner la marque épigénétique H3K36me3. Cette enzyme fait partie de la famille des histone méthyltransférases à domaine SET et catalyse le transfert d'un groupe méthyl sur la lysine cible à partir du cofacteur S-adénosylméthionine (SAM). La marque H3K36me3, est impliquée dans plusieurs processus cellulaires dont la régulation de la transcription et la réparation de l'ADN. SETD2 est décrite comme un suppresseur de tumeur parmi les plus fréquemment mutés dans les cancers (carcinomes rénaux à cellules claires et leucémies). Malgré l'importance de cet enzyme, les données concernant la caractérisation de ces mutations restent parcellaires. Ce travail de thèse a consisté à caractériser au niveau structural et fonctionnel la mutation L1609P de SETD2 par des approches de biochimie moléculaire et cellulaire et de cristallographie. Cette mutation a été identifiée chez des patients en rechute leucémique après chimiothérapie. Nous avons pu obtenir la structure cristallographique du mutant SETD2 L1609P à 2.2 Å. Celle-ci révèle que la mutation entraine des changements conformationnels au niveau du site actif l'enzyme. Cette observation est en accord avec des expériences de dosage d'activité de SETD2 montrant que le mutant est peu actif sur histone H3 purifiée ou présente au sein de nucléosomes (25% d'activité résiduelle). L'utilisation de cellules HEK293 modifiées par approche CRISPR/Cas9 pour exprimer le mutant SETD2 L1609P confirme l'impact de la mutation sur l'activité de l'enzyme qui entraine une baisse significative de la marque H3K36me3 dans les cellules. Nous avons par ailleurs montré que le mutant L1609P est peu exprimé du fait de la formation d'agrégats (puncta) nucléaires "ubiquitinés" et dégradés par le protéasome. Notre travail confirme également que la mutation L1609P de SETD2 confère une résistance à l'apoptose suite à un traitement des cellules à l'étoposide. Ce travail a permis de poser les bases moléculaires et structurales de l'impact d'une mutation oncogénique de SETD2 acquise après rechute. En parallèle à ces travaux, nous nous sommes également intéressés à l'étude structuralle et fonctionnelle d'une mutation oncogénique de l'histone acétyltransférase MOZ (MOnocytic leukemia Zing finger). Cette enzyme fait partie de la famille des lysine acétyltransférases à domaine MYST et a pour substrat l'histone H3 (notamment H3K23) et des protéines non-histone telles que p53. Des altérations génétiques de MOZ (mutations ou translocations génomique) sont impliquées dans des hémopathies malignes et d'autre types de cancers. L'impact moléculaire et fonctionnel de ces altérations reste toutefois peu documenté. Notre étude a porté sur la mutation T605P identifiée dans des cancers colorectaux. Cette mutation se situe dans le domaine catalytique de l'enzyme en juxtaposition avec la lysine 604 (K604) dont l'auto-acétylation est décrite comme d'importance pour l'activité enzymatique. Par des approches de biochimie des protéines et d'enzymologie, nous avons montré que le mutant MOZ T605P était incapable d'acétyler l'histone H3 et la protéine p53 mais gardait sa capacité à s'auto-acétyler. L'analyse de cellules HEK293 modifiées par CRISPR/Cas9 exprimant le mutant MOZ T605P confirme la perte d'activité de l'enzyme et la diminution concomitante de la marque épigénétique H3K23ac. Par ailleurs, nous avons résolu la structure cristallographique de MOZ T605P à 2.9 Å et montrons que la mutation entraine un réarrangement du site actif conduisant à un encombrement stérique pour la fixation de la lysine cible. La structure du mutant MOZ T605P confirme également sa capacité à s'auto-acétyler sur la lysine 604. Ces travaux permettent à la fois d'appréhender l'impact moléculaire et fonctionnel de mutations oncogéniques de MOZ et de mieux comprendre la machinerie catalytique de cette enzyme.
Domaines
Biologie moléculaire| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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