Dynamic monitoring of photosynthesis in light-acclimated organisms
Imagerie par contraste dynamique de la fluorescence endogène des plantes
Résumé
This CIFRE PhD work between ENS and Sony CSL Paris led to design a new instrument and new protocols to characterize the physiological status of photosynthetic organisms. This objective was addressed at the single-cell level to quantify 3 light-stress response mechanisms in the microalgae Chlamydomonas reinhardtii. It further lays the grounds of the European project DREAM and addresses the constraints that come with the level of generalization and applicability of DREAM. Chapter 1 describes the specifications for the epifluorescence microscope developed. A strong accent was put on modularity and automation. The long-term DREAM objective to provide an affordable portable device was also taken into account in the design and hardware choices. The calibration and quality control of the instrument is described. The calibration of light intensity led to an extended work on the use of fluorescent actinometers in the visible spectrum, in 1D, 2D and 3D. It resulted in an accepted manuscript entitled «Fluorescence to measure light intensity». Chapter 2 deals with the role of chlorophyll fluorescence (ChlF) in remote sensing of photosynthesis. The concept of de-excitation pathways of the energy harvested by the photosynthetic organisms is described, allowing to introduce the classical methods in ChlF remote sensing. The submitted manuscript «Leaves to measure light intensity» is introduced to describe the diversity of light-dependent phenomena in plants. The challenge to adapt the current protocols to an imaging system with a CMOS camera at the single-cell algae level was lifted by using a new light protocol, and validated. Chapter 3 describes in a manuscript the case study of the light-stress response in Chlamydomonas reinhardtii after having introduced key concepts in the biological process studied and the computational methods used. The experiments consisted in collecting a video of ChlF time traces, and retrieve the individual responses by image segmentation. The three light-stress responses studied are entangled and have dynamic signatures that overlap within the ChlF time trace. A machine learning framework was introduced to convert the ChlF traces into stress scores. A reference dataset was built to train the framework. Biological protocols including mutant strains and sample preparation were introduced to probe the stresses separately and build the reference populations of the dataset. The framework consisted in two parts. Dictionary learning first reduced the dimension of the ChlF traces with optimized reconstruction. It was followed by a dimension reduction using Linear Discriminant Analysis to maximize the separability of the annotated classes. This combination allowed to represent a general stress response along three dimensions, each axis representing one single stress response. This method could unmix the stress responses within the ChlF traces of wild-type strains. An emphasis was put on the reconstruction capability of the pipeline, which can be used as a criterion to validate the hypothesis made to build the latter, or to identify new stress-responses. Chapter 4 presents in a manuscript the open-source hardware reproduction of the instrument, demonstrating the reproducibility of the work but also providing instructions to allow the community to reproduce it. It also introduces tools to control in a modular way several devices and to implement a database system which can be useful when designing Data Management Plans.
Ce travail de thèse CIFRE entre l'ENS et Sony CSL Paris a abouti à la conception d'un nouvel instrument et de nouveaux protocoles pour caractériser l'état physiologique des organismes photosynthétiques. Cet objectif a été abordé au niveau de la cellule individuelle afin de quantifier les mécanismes de réponse au stress lumineux chez la microalgue Chlamydomonas reinhardtii. Il pose également les bases du projet européen DREAM et aborde les contraintes liées au niveau de généralisation et d'applicabilité de DREAM. Le chapitre 1 décrit les spécifications du microscope à épifluorescence développé. Un accent a été mis sur la modularité et l'automatisation. L'objectif à long terme de DREAM, qui est de fournir un dispositif portable abordable, a également été pris en compte dans la conception et les choix matériels. La calibration et le contrôle de qualité de l'instrument sont décrits. La calibration de l'intensité lumineuse a donné lieu à un travail approfondi sur l'utilisation d'actinomètres fluorescents dans le spectre visible, en 1D, 2D et 3D. Cela a abouti à un manuscrit accepté intitulé "Fluorescence to measure light intensity". Le chapitre 2 traite du rôle de la fluorescence de la chlorophylle (ChlF) dans la détection de la photosynthèse. Le concept des voies de désexcitation de l'énergie captée par les organismes photosynthétiques est décrit, ce qui permet d'introduire les méthodes classiques de détection de la ChlF. Le manuscrit soumis "Leaves to measure light intensity" est présenté pour décrire la diversité des phénomènes dépendant de la lumière chez les plantes. Le défi d'adapter les protocoles actuels à un système d'imagerie avec une caméra CMOS au niveau des microalgues unicellulaires a été relevé en utilisant un nouveau protocole lumineux, qui a été validé. Le chapitre 3 décrit dans un manuscrit l'étude de cas de la réponse au stress lumineux chez Chlamydomonas reinhardtii, après avoir introduit les concepts clés du processus biologique étudié et des méthodes computationnelles utilisées. Les expériences ont consisté à collecter des vidéo des traces temporelles de ChlF et à récupérer les réponses individuelles par segmentation d'image. Les trois réponses au stress lumineux étudiées sont entrelacées et présentent des signatures dynamiques qui se chevauchent dans les traces temporelles de ChlF. Une structure d'apprentissage automatique a été introduite pour convertir les traces de ChlF en scores de stress. Un ensemble de données de référence a été construit pour entrainer la structure . Des protocoles biologiques comprenant des souches mutantes et la préparation des échantillons ont été introduits pour étudier les stress séparément et construire les populations de référence de l'ensemble de données. La structure se compose de deux parties.L'apprentissage par dictionnaire réduit la dimension des traces temporelles de ChlF avec une reconstruction optimisée. Il est suivi d'une réduction de dimension à l'aide d’une LDA (Linear Discriminant Analysis) pour maximiser la séparabilité des classes annotées. Cette combinaison a permis de représenter une réponse générale au stress le long de trois dimensions, chaque axe représentant une réponse au stress spécifique. Cette méthode a pu décomposer les réponses au stress dans les traces de ChlF des souches de type sauvage. Une importance particulière a été accordée à la capacité de reconstruction du pipeline, qui peut être utilisée comme critère pour valider les hypothèses formulées pour sa construction ou pour identifier de nouvelles réponses au stress. Le chapitre 4 présente dans un manuscrit la reproduction open-source du matériel de l'instrument, démontrant ainsi la reproductibilité du travail et fournissant des instructions pour permettre à la communauté de le reproduire. Il introduit également des outils de contrôle modulaire de plusieurs dispositifs et de mise en place d'un système de base de données, qui peut être utile lors de la conception de plans de gestion des données.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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