Les protéines à domaines LIM chez le protoplaste de tournesol (Helianthus annuus L.) : expression des gènes et cytolocalisation - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2000

LIM proteins in sunflower protoplasts (Helianthus annuus L.) : genes expression and cytolocalisation

Les protéines à domaines LIM chez le protoplaste de tournesol (Helianthus annuus L.) : expression des gènes et cytolocalisation

Résumé

LIM proteins have been described as developmental regulators of eucaryotic organisms. They are characterized by the presence of one or several double zinc finger motifs, called LIM domains, in their sequence, which function by mediating protein-protein interactions. LIM proteins have the ability to interact with multiple protein partners. The majority of LIM proteins have been characterized in animal cells where they have been localized in the nucleus and in the cytoplasm. Nuclear LIM proteins, owing to their capacity to mediate numerous interactions, play an important role in the regulation of transcription. These proteins are involved in the control of key developmental processes, like cell division and embryonic development. Cytoplasmic LIM proteins are generally associated to actin cytoskeleton, and could regulate cytoskeleton dynamic. Several LIM proteins have been described to date in plants, but the biological functions of these proteins remained to be determined. To study the function of LIM proteins in sunflower, sunflower hypocotyl protoplasts were used as experimental model, as theirdevelopment can be modulated by varying culture conditions.
Using primer sets specific for each of the previously described LIM genes from sunflower, we have studied their expression in sunflower protoplasts by RT-PCR. We detected a transcript only for the gene HaWLIM-1, but not for the other two genes HaPLIM-1 and HaPLIM-2. On immunowestern blots, polyclonal antibodies directed against HaWLIM-1 protein recognized two proteins of 52 and 78 kDa respectively, indicating that the protein is not present as the 21 kDa monomer but rather as stable higher molecular structures. Immunocytolocalization studies showed that HaWLIM-1 is located in the nucleus and in the cortical cytoplasm. In the nucleus, it concentrated mainly in the nucleolus and could therefore play a role in the transcription of rRNA genes or the assembly of ribosomes. In the cytoplasm, different approaches, including double labelling and drug application, showed a strong colocalization of HaWLIM-1 with microtubules, suggesting a role in cytoskeleton organization.
HaWLIM-1 gene expression decreases during protoplast culture. Immunoblot experiments showed that antibodies directed against HaWLIM-1 recognized new proteins during culture, indicating that HaWLIM-1 protein could interact with other high molecular structures during protoplast development. Moreover, HaWLIM-1 protein showed a strong colocalization with microtubules during all the steps of cell division.
Les protéines LIM constituent une famille de molécules régulatrices possédant dans leur séquence protéique un ou plusieurs motifs en doigts de zinc – les domaines LIM – dont la fonction principale est de diriger les interactions protéine-protéine. Les protéines LIM ont ainsi la capacité d'interagir avec de multiples partenaires protéiques, et participent à l'assemblage et au maintien de certains des complexes macromoléculaires présents au sein de la cellule. La plupart des protéines LIM ont été caractérisées dans les cellules animales, où elles sont impliquées dans l'organisation du cytosquelette d'actine, ainsi que dans la régulation de la transcription. A ce jour, seules quelques protéines LIM ont été décrites chez les végétaux. La fonction de ces protéines LIM végétales reste encore à identifier. Afin de préciser le rôle des protéines LIM chez le tournesol, nous avons choisi comme modèle expérimental le protoplaste d'hypocotyle de tournesol, en raison de la possibilité de moduler son développement en fonction des conditions de culture.
Nous avons étudié l'expression des gènes LIM précédemment décrits chez le tournesol dans les protoplastes par RT-PCR. Nous avons détecté un transcrit pour le gène HaWLIM-1, mais pas pour les deux autres gènes HaPLIM-1 et HaPLIM-2. Des anticorps polyclonaux spécifiques de la protéine HaWLIM-1 reconnaissent en immunoblot deux polypeptides distincts, dont les masses moléculaires sont respectivement de 52 kDa et 78 kDa. Ces masses moléculaires sont nettement supérieures à la taille attendue pour la protéine HaWLIM-1. Ces résultats indiquent que la protéine n'est pas présente sous forme de monomères dans les protoplastes, mais qu'elle participe à la formation de complexes protéiques stables.
L'étude par immunocytologie de la localisation intracellulaire de la protéine HaWLIM-1 révèle que cette protéine est présente simultanément dans deux compartiments distincts : le noyau et le cytoplasme. Dans le noyau, elle s'accumule préférentiellement dans le nucléole, et pourrait jouer un rôle dans la régulation de la transcription des gènes des ARNr, ou dans l'assemblage des ribosomes. Dans le cytoplasme, différentes approches, incluant des expériences de double-marquage et de déstructuration de composants du cytosquelette, ont permis de mettre en évidence une très forte colocalisation de la protéine HaWLIM-1 avec les microtubules, ce qui suggère un rôle pour cette protéine dans l'organisation du cytosquelette.
Lors de la culture des protoplastes, le gène HaWLIM-1 s'exprime constamment, avec cependant des variations dans le niveau d'expression. Des expériences d'immunoblot utilisant les anticorps spécifiques de la protéine HaWLIM-1 indiquent que de nouveaux polypeptides, de masses moléculaires égales à 35 kDa, 42 kDa et 64 kDa, apparaissent au cours de la culture. Cette observation suggère que la protéine HaWLIM-1 possède la capacité de s'associer et de se dissocier avec de nouveaux complexes protéiques au cours du développement. La protéine HaWLIM-1 est associée aux microtubules pendant tous les stades de la division : elle est présente au niveau de la bande préprophasique à la fin de l'interphase, au niveau du fuseau mitotique pendant la mitose, et au niveau du phragmoplaste pendant la cytokinèse. Ces observations semblent indiquer que la protéine HaWLIM-1 occupe une fonction importante au niveau des microtubules.
Fichier principal
Vignette du fichier
These-Anne-Claire-Bordel.pdf (12.33 Mo) Télécharger le fichier

Dates et versions

tel-00012190 , version 1 (28-04-2006)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00012190 , version 1

Citer

Anne-Claire Bordel. Les protéines à domaines LIM chez le protoplaste de tournesol (Helianthus annuus L.) : expression des gènes et cytolocalisation. Biochimie [q-bio.BM]. Institut National Polytechnique de Toulouse - INPT, 2000. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00012190⟩
238 Consultations
716 Téléchargements

Partager

Gmail Facebook X LinkedIn More