Kinetic analysis of RNA interference in nuclear and cytoplasmic compartments in mammalian cells
Analyse cinétique de l'interférence par l'ARN dans les compartiments nucléaire et cytoplasmique des cellules de mammifères
Résumé
RNA interference (RNAi) is a mechanism by which double stranded RNA trigger the sequence specific degradation of RNA. In mammalian cells, RNAi can be induced by short interfering RNA (siRNA). RNAi is carried out by the RISC complex (RNA induced silencing complex) that contains at least the RNA guide sequence and the Ago2 nuclease, enabling target identification and cleavage, respectively.
In this thesis we focused on the kinetic analysis of the mRNA degradation induced by siRNA in mammalian cells. We measured the half-lives of the β-globin and lymphotoxin-α (LTα) silenced mRNA and showed that these kinetics reflected in part the efficiency of silencing of the corresponding siRNA. However, we also observed for two efficient siRNA, that the degradation kinetics accelerate between 16 h and 24 h after transfection. In addition, the observation that the same siRNA induce different inhibitions for the two LTα messengers has led us to propose an interaction between translation and RNA interference.
We have investigated the impact of RNA interference on the nuclear mRNA metabolism. We thus demonstrated that siRNA induce the degradation of nuclear RNA with an efficacy that depends on a kinetic competition between interference and processing reactions involving the targeted transcript (splicing, transport). Moreover, we observed that the degradation of a messenger RNA could be accompanied by the accumulation of its precursors, probably due to a higher RNA synthesis. Thus, interference can shed light on new regulations of the nuclear mRNA metabolism.
In this thesis we focused on the kinetic analysis of the mRNA degradation induced by siRNA in mammalian cells. We measured the half-lives of the β-globin and lymphotoxin-α (LTα) silenced mRNA and showed that these kinetics reflected in part the efficiency of silencing of the corresponding siRNA. However, we also observed for two efficient siRNA, that the degradation kinetics accelerate between 16 h and 24 h after transfection. In addition, the observation that the same siRNA induce different inhibitions for the two LTα messengers has led us to propose an interaction between translation and RNA interference.
We have investigated the impact of RNA interference on the nuclear mRNA metabolism. We thus demonstrated that siRNA induce the degradation of nuclear RNA with an efficacy that depends on a kinetic competition between interference and processing reactions involving the targeted transcript (splicing, transport). Moreover, we observed that the degradation of a messenger RNA could be accompanied by the accumulation of its precursors, probably due to a higher RNA synthesis. Thus, interference can shed light on new regulations of the nuclear mRNA metabolism.
L'interférence par l'ARN (ARNi) désigne la dégradation spécifique de séquence des ARN induite par des ARN double brin. Dans les cellules de mammifères, l'ARNi peut être induite par des petits ARN interférants (siARN). L'ARNi est effectuée par le complexe RISC (RNA induced silencing complex) contenant, entre autre, la séquence d'ARN guide, qui permet la reconnaissance de la cible et la nucléase Ago2, responsable de son clivage.
Ces travaux ont porté sur l'analyse cinétique de la dégradation des ARNm induite par les siARN dans des cellules de mammifères. Nous avons mesuré les vitesses de dégradation des ARNm de β-globine et de lymphotoxine-α sous interférence et montré, d'une part, que les différences d'efficacité des siARN sont liées à des différences de vitesses de dégradation et, d'autre part, que ces vitesses s'accélèrent entre 16h et 24h après la transfection pour deux siARN inhibant 80 à 90% des messagers. Nous avons aussi observé qu'un même siARN induit des inhibitions différentes pour les deux messagers de la lymphotoxine-α, ce qui nous a amené à proposer l'existence d'une interaction entre la traduction et l'interférence par l'ARN.
Nous avons analysé l'impact de l'interférence sur le métabolisme nucléaire des ARNm. Nous avons ainsi démontré que les siARN induisent la dégradation des ARN nucléaires avec une efficacité qui dépend d'une compétition cinétique entre l'interférence et les réactions de maturation et d'export qui affectent le transcrit ciblé. De plus, nous avons observé que la dégradation d'un ARN messager pouvait s'accompagner d'une accumulation de ses précurseurs, probablement par une augmentation de synthèse. Ainsi, l'interférence permet-elle de mettre en évidence de nouvelles régulations du métabolisme nucléaire des ARN.
Ces travaux ont porté sur l'analyse cinétique de la dégradation des ARNm induite par les siARN dans des cellules de mammifères. Nous avons mesuré les vitesses de dégradation des ARNm de β-globine et de lymphotoxine-α sous interférence et montré, d'une part, que les différences d'efficacité des siARN sont liées à des différences de vitesses de dégradation et, d'autre part, que ces vitesses s'accélèrent entre 16h et 24h après la transfection pour deux siARN inhibant 80 à 90% des messagers. Nous avons aussi observé qu'un même siARN induit des inhibitions différentes pour les deux messagers de la lymphotoxine-α, ce qui nous a amené à proposer l'existence d'une interaction entre la traduction et l'interférence par l'ARN.
Nous avons analysé l'impact de l'interférence sur le métabolisme nucléaire des ARNm. Nous avons ainsi démontré que les siARN induisent la dégradation des ARN nucléaires avec une efficacité qui dépend d'une compétition cinétique entre l'interférence et les réactions de maturation et d'export qui affectent le transcrit ciblé. De plus, nous avons observé que la dégradation d'un ARN messager pouvait s'accompagner d'une accumulation de ses précurseurs, probablement par une augmentation de synthèse. Ainsi, l'interférence permet-elle de mettre en évidence de nouvelles régulations du métabolisme nucléaire des ARN.