Antimicrobial Peptides from enterobacteria
Maturation process of the antibacterial RNA polymerase inhibitor microcin J25, and study of its bacterial uptake mechanism
Peptides antimicrobiens des entérobactéries
Etude de la voie de maturation et du mécanisme d'import de la microcine J25, peptide antimicrobien inhibiteur de l'ARN polymérase
Résumé
Microcin J25 (MccJ25) is a gene-encoded peptide naturally secreted by Escherichia coli AY25. Its potent antibacterial activity results from the inhibition of bacterial RNA polymerase. It exhibits a lasso-type three-dimensional structure, which results from the cleavage of its inactive precursor, McjA, and athe formation of a Gly1-Glu8 amide bond. We showed in vivo and in vitro that MccJ25 utilizes the bacterial iron-siderophore transporter FhuA for uptake into bacteria. MccJ25 binds to FhuA with a Kd of 1.2 µM and a 2:1 stoichiometry. The Val11-Pro16 beta hairpin region of the MccJ25 lasso structure was shown to be required for this recognition step. We have then studied MccJ25 biosynthetic pathway. Gene inactivation and complementation assays showed that two enzymes, namely McjB and McjC, which are encoded by the microcin gene cluster, are required for the microcin maturation process. In vitro, McjB and McjC were shown to be sufficient to achieve the conversion of McjA into mature MccJ25, all proteins being obtained by recombinant expression in E. coli. From sequence similarity studies, we propose that McjB is responsible for the cleavage of McjA and that McjC is in charge of the Gly1-Glu8 bond formation.
La microcine J25 (MccJ25) est un peptide antibactérien inhibiteur de l'ARN polymérase, produit par Escherichia coli AY25 selon la voie ribosomique. Sa structure tridimensionnelle en forme de lasso résulte du clivage d'un précurseur, McjA, et de la formation sur le peptide C-terminal résultant, d'une liaison amide Gly1-Glu8. Nous avons d'abord étudié le mode d'import de MccJ25 dans les bactéries et avons montré in vivo et in vitro qu'elle parasite un transporteur du complexe fer/ferrichrome, FhuA. Ainsi, MccJ25 se lie à FhuA avec un Kd de 1.2 µM, pour former un complexe de stœchiométrie 2:1. La boucle en épingle à cheveu béta définie par les résidus Val11-Pro16 de MccJ25 est nécessaire à cette étape de reconnaissance. Dans un second temps, nous avons étudié la biosynthèse de MccJ25. Nous avons montré par inactivation et complémentation de gènes que les deux protéines, McjB et McjC codées par le cluster génétique de la microcine, sont nécessaires au processus de maturation. McjA, McjB et McjC produites en système recombinant ont permis de montrer que McjB et McjC sont capables de catalyser la conversion de McjA (précurseur linéaire inactif) en MccJ25 dotée d'activité antibactérienne et structurée en lasso. L'étude des similarités de séquences de McjB et McjC indique que McjB serait responsable du clivage protéolytique de McjA et McjC de la formation de la liaison Gly1-Glu8.