Mécanismes de diffusion facilitée de l'enzyme de restriction EcoRV. - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2007

Facilitated diffusion mechanisms of EcoRV restriction enzyme.

Mécanismes de diffusion facilitée de l'enzyme de restriction EcoRV.

Isabelle Bonnet

Résumé

Some proteins can rapidly locate a short recognition site within large DNA using "facilitated diffusion", a process in which protein first bind to the DNA via non-specific interactions and then translocate along DNA to the specific sequence. "Sliding" (1D diffusion) and "jumping" (3D translocations) on DNA are two mechanisms that are believed to accelerate target location, but their respective roles in facilitated diffusion remains to be clarified.
Using total internal fluorescence microscopy, we studied the "facilitated diffusion" of the restriction endonuclease EcoRV along stretched DNA on the single molecule level. In addition to sliding, we observed jumps which were demonstrated to stem from 3D excursions of the enzyme between distant DNA sites. We developed an analytical model based on 3D diffusion to account for both the jump frequency and the jump length distribution. We deduced from our study key parameters regarding the facilitated diffusion of EcoRV, such as the 1D diffusion coefficient (D1 ~ 0.01 µm2.s-1) and the number of jumps (~ 20) occurring during an interaction event with non-specific DNA.
Certaines protéines qui interagissent avec l'ADN sont capables de trouver rapidement une séquence spécifique de quelques paires de bases. Pour expliquer ce phénomène connu des biologistes depuis longtemps, plusieurs mécanismes de localisation appelés diffusion facilitée ont été proposés. Tous supposent une association initiale à de l'ADN non spécifique, suivie d'une translocation le long de l'ADN jusqu'au site de reconnaissance. Le mécanisme qui sous-tend cette translocation est toujours discuté. Il pourrait impliquer une diffusion linéaire (sliding) et/ou une série de sauts (jumping).
Pour élucider ce mécanisme, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence par onde évanescente pour visualiser l'interaction non spécifique de l'enzyme de restriction EcoRV. Dans nos expériences in vitro, l'ADN est étiré au dessus d'une surface et les enzymes sont couplées à des fluorophores. Nous avons ainsi visualisé les processus de sliding et de jumping et mesuré le coefficient de diffusion 1D des enzymes (D1 ~ 0,01 µm2.s-1) ainsi que le nombre de saut par interaction (~ 20). Un modèle simple a permis à partir des résultats expérimentaux de caractériser la diffusion facilitée d'EcoRV.
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Dates et versions

tel-00197580 , version 1 (14-12-2007)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00197580 , version 1

Citer

Isabelle Bonnet. Mécanismes de diffusion facilitée de l'enzyme de restriction EcoRV.. Biophysique [physics.bio-ph]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2007. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00197580⟩
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