Interactions at molecular scale and assembly mechanisms between two proteins : α-lactalbumine and lysozyme.
Interactions à l'échelle moléculaire et mécanismes d'assemblage de deux protéines alimentaires : l'α-lactalbumine et le lysozyme.
Résumé
Many researches focus on the design of biomaterials using the self-assembly properties of proteins since the resulting supramolecular objects exhibit many potential applications for food, pharmaceutical and biotechnology industries. The understanding of the driving forces governing protein assembly is a prerequisite to control the stability, morphology and functionalities of the resulting objects. This study focuses on the binary system composed of oppositely charged proteins: the lysozyme (LYS) and the α-lactalbumine (LAC). LYS interacts with calcium-loaded (holo) and calcium-depleted (apo) forms of LAC to form heterodimers. Only the apoLAC-LYS dimers further assemble into supramolecular objects with morphologies depending on the temperature. When apoLAC is in a native conformation, the assembly results in amorphous aggregates, whereas ordered spherical objects, called microspheres, are obtained when it adopts a conformational state with a particular flexibility, called "molten globule". In order to understand how the information contained at molecular scale are spread on microscopic scale, my PhD thesis objectives were to characterize the interactions involved at molecular level and to establish the assembly mechanism. The identification of the residues composing the heterodimers interfaces evidenced a preferential orientation of proteins resulting from electrostatic attractions, and the formation of tetramers by association of the apoLAC-LYS dimers. Sub-micrometric particles growth, from the nuclei formed by the aggregation of tetramers, is independent of the temperature and governed by collision and fusion of smaller particles. At the final stage of the mechanism, the conformational state of apoLAC plays an important role. The coalescence of particles and reorganisation of proteins into microspheres is favoured by the flexibility of the molten globule and probably involve hydrophobic interactions. Finally, the microspheres formation does not involved drastic secondary structure changes of assembled proteins, which explains the reversibility of the objects and the dynamic behaviour of assembled proteins. The experimental strategy adopted to perform this work can be translated to study the assembly of other protein binary systems and the obtained fundamental elements can be used to envisage potential applications of the microspheres.
Le développement de biomatériaux utilisant les propriétés d'auto-assemblage des protéines est au cœur de nombreuses recherches car les objets supramoléculaires résultants présentent un large potentiel applicatif pour les industries agroalimentaire, pharmaceutique et biotechnologique. La compréhension des forces gouvernant l'assemblage des protéines est essentielle pour contrôler la stabilité, la morphologie et les fonctionnalités des objets formés. Cette étude s'intéresse au système binaire composé de protéines de charges opposées : le lysozyme (LYS) et l'α-lactalbumine (LAC). Le lysozyme interagit avec les formes calcifiée (holo) et décalcifiée (apo) de l'α-lactalbumine pour former des hétérodimères. Seuls les hétérodimères apoLAC-LYS s'assemblent en objets supramoléculaires dont la morphologie dépend de la température. Lorsque l'apoLAC est dans sa conformation native (T< 26°C), des agrégats amorphes sont obtenus, alors que des objets sphériques ordonnés, appelés microsphères, sont obtenus lorsqu'elle adopte un état conformationnel particulièrement flexible, appelé " molten globule " (45°C). Pour comprendre comment l'information contenue à l'échelle moléculaire se propage à l'échelle microscopique, les objectifs de ma thèse étaient de caractériser les interactions impliquées à l'échelle moléculaire et d'établir le mécanisme d'assemblage. L'identification des acides aminés impliqués dans l'interface des hétérodimères a mis en évidence une orientation particulière des protéines gouvernée par des attractions électrostatiques et la formation de tétramères par associations des dimères apoLAC-LYS. La croissance de particules sub-micrométriques, à partir des nucléi formés par agrégation des tétramères, est indépendante de la température et est gouvernée par collision et fusion de particules plus petites. C'est au stade final du mécanisme, que l'état conformationnel de l'apoLAC joue un rôle important. En effet, la coalescence des particules et la réorganisation des protéines en microsphères sont favorisées par la flexibilité du " molten globule " et impliquent probablement des associations hydrophobes. Enfin, la formation de microsphères n'implique pas de changements importants de structure secondaire des protéines assemblées, ce qui explique la réversibilité des objets formés et le dynamisme des protéines assemblées. L'approche mise en œuvre pour réaliser ce travail peut être utilisée pour étudier l'assemblage d'autres systèmes protéiques binaires et les éléments fondamentaux apportés permettent d'envisager des applications potentielles des microsphères.