Toward a single molecule study of asymmetric experiment - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2010

Toward a single molecule study of asymmetric experiment

Vers une étude de la division asymétrique des cellules à l'échelle de la molécule unique

Résumé

The goal of this project is to develop novel tools to explore dynamic organizational processes in living cells, with unprecedented detail and sensitivity. In particular, we are interested in the process of asymmetric cell division (ACD), during which a mother cell divides asymmetrically into two different daughter cells. This process is a key mechanism in the generation of cellular diversity in organisms of all levels. During the course of ACD, prior to the separation of the mother cell into daughter cells, it needs to generate an asymmetric spatial distribution for some of its content. This symmetry-breaking process is called polarization i.e. the generation of a polarized structure. One of the ways to study polarization is to characterize the intra-cellular transport mechanisms that generate it. As a means to observe intra-cellular transport in detail, we employ single-molecule methods, which allow us to separately follow (or track) the movement of single molecules. By observing one event at a time we can obtain much more information about the process, compared to simultaneous measurements of the entire population. We are using novel and powerful fluorophores, quantum dots (QDs), which allow for single molecule detection and tracking. On the technical level, we developed methods to cope with certain technical difficulties associated with intra-cellular, single-molecule, tracking experiments. These include the delivery of such fluorophores into living cells, the targeting of specific molecules of interest, as well as control over the stoichiometry of QD-protein complexes. The project combines different disciplines, such as single molecule imaging, molecular biology, and primary cell culture, thereby covering almost all aspects of an in-vivo single-molecule experiment.
Le but de ce projet est de développer de nouveaux outils pour explorer des processus d'organisation intracellulaire dynamique dans les cellules vivantes, avec une sensibilité sans précédent. Ce travail se concentre sur deux aspects principaux : le développement d'outils pour l'étude en molécule unique de la division cellulaire asymétrique, et la mise au point de sondes monovalentes qui permettent le suivi d'une protéine individuelle utilisant un nanocristal semiconducteur (ou quantum dot, QD). La division cellulaire asymétrique (DCA) est définie comme une division cellulaire dans laquelle une cellule mère donne naissance à deux cellules filles avec des destins différents (ce qui se manifeste à travers par exemple la taille, le contenu ou le profil d'expression). Notre étude se concentre sur la division cellulaire asymétrique dans les cellules souches neurales de Drosophila melanogaster, appelés neuroblastes. Au cours de la division asymétrique des neuroblasts, avant la séparation de la cellule-mère en deux cellules-filles, certaines molécules dans le cytoplasme se redistribuent de façon asymétrique (polarisée). Ce travail a montré la faisabilité de l'étude de la division cellulaire asymétrique à l'échelle de la molécule unique. Les méthodes ont été conçues et développées pour la conjugaison et la caractérisation des complexes QD-protéines. Nous avons réussi à cibler les protéines localisées de manière asymétrique dans des neuroblastes en division. Cela ouvre la voie à des études intracellulaires de ce phénomène, en utilisant des QDs individuels Ce travail a également mis en évidence la limite principale de ce système expérimental : la nature tridimensionnelle des mouvements. En raison de l'épaisseur de la neuroblate, les QDs sortent du plan focal très souvent. En conséquence, l'obtention des trajectoires suffisamment longues pour le calcul des paramètres de transport, devient très difficile. Toutefois, certaines informations peuvent encore être extraites des données que nous avons obtenues, en analysant la répartition spatiale de "courts-déplacements" dans les films obtenus. Les déplacements des QDs entre deux images consécutives sont regroupés et analysés en fonction de leur emplacement par rapport à une carte polaire normalisée d'un neuroblaste polarisé. Une telle analyse n'a pas besoin des trajectoires longues mais peut, quand même, révèler des differences dans la mobilité des protéines entre les differents domaines de la cellule. Cette analyse est actuellement en cours. Nous avons aussi réussi à produire des sondes monovalentes pour le suivi des proteines membranaires extracellulaires. Ces sondes sont basées sur un fragment de chaîne variable d'anticorp (ScFv). Ces sondes doivent avoir des nombreuses applications dans le suivi des diverses protéines membranaires, mais doivent être améliorées afin de répondre aux exigences rigoureuses du suivi intracellulaire.
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Dates et versions

tel-00815355 , version 1 (18-04-2013)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00815355 , version 1

Citer

Assa Sittner. Toward a single molecule study of asymmetric experiment. Biological Physics [physics.bio-ph]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2010. English. ⟨NNT : 2010PA066095⟩. ⟨tel-00815355⟩
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