Structure, biogenèse et expression de la protéine T du complexe de la Glycine décarboxylase des plantes supérieures (Pisum sativum) - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 1996

Structure, biogenèse et expression de la protéine T du complexe de la Glycine décarboxylase des plantes supérieures (Pisum sativum)

Pierre Vauclare

Résumé

My present interest concerns the structure, the fonction and the biogenesis of the glycine decarboxylase complex. The glycine decarboxylase complex (GDC) is a multienzymatic system present in the mitochondria of both animal and plant cells, which catalyzes the oxidative decarboxylation of glycine into CO2, NH3, NADH and 5,10 methylenetetrahydroptaroylpoly glutamate (CH2-H4PteGlun) (Kikuchi and Hiraga, 1982; Walker and Oliver, 1986a; Bourguignon et al., 1988). * The aim of my work during my PhD thesis was first to determine the structure and to study biogenesis of the T protein (a tetrahydrofolate enzyme) implicated in the glycine decarboxylase complex. When purifying the T protein from pea (Pisum Sativum), I gained experience in cell biochemistry techniques such as plant cell fractionation, preparation of large amount of pure and intact mitochondria. In addition, I became familiar with the purification of protein using Pharmacia FPLC (Pharmacia) system and the general methods for handling proteins and antibodies. To study the primary structure of the T protein, I isolated a specific clone from a pea leaf cDNA library in *gt 11 using monospecific polyclonal antibodies raised against the T protein. Analysis with HPLC-MS (reverse-phase high-performance liquid chromatography/ mass spectrometry) and microsequenciing of some peptides obtained by chemical cleavage, confirmed the mass predicted from the isolated cDNA and 35 % of the total amino acid sequence. I could show that T protein and its transcript specifically accumulated in the leaf tissue with an additionnal induction by light. I am also studying the biogenesis of the GDC complex during the development of pea plants. For that purpose I measure several parameters such as glycine oxidation, GDC proteins and transcripts levels at different stages of development. * The second aim of my work was to isolate a gene encoding for the T protein. With the T cDNA as a probe, I screened a pea genomic library in EMBL 3. For the first time, the gene coding for the T protein with its promoter region was characterized and sequenced. The transcription start site has been determined by primer extension. Now, I am involved, in the study of the T gene regulation and in a project dealing with the expression of the T protein in Escherichia coli using a T7 RNA polymerase plasmid expression system. Indeed, cristallisation and site-directed mutagenesis will be necessary to understand how the T protein interacts with its cofactor and other proteins of the GDC complex such as the H protein.
Nous avons utilisé des anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine T du complexe de la glycine décarboxylase (GDC) pour isoler un ADNc de 1430 pb codant pour la protéine T de pois. L'analyse de la séquence nucléotidique a montré que la protéine T était synthétisée sous forme d'un précurseur comportant un peptide de transit mitochondriale de 30 aminoacides précédant la protéine T mature qui comporte 378 aminoacides. La masse déduite de la séquence primaire est de 40 961 Da et correspond exactement à la valeur mesurée au spectromètre de masse, ce qui indique que le cofacteur de la protéine T, le tétrahydrofolate n'est pas fixé de manière covalente sur la protéine. La structure primaire de la protéine T a pu également être confirmée par analyse en HPLC-ESI/MS et par microséquençage des fragments générés par protéolyse chimique de la protéine T purifiée. Des homologies de séquences avec les protéines T de foie de poulet, de boeuf et de pomme de terre, nous ont permis de localiser des régions hautement conservées comportant des résidus chargés positivement qui pourrait être impliquées dans les intéractions avec le tétrahydrofolate. L'étude de l'expression de la protéine T par Northern et Western-blot a montré que la protéine T et les messagers correspondants était principalement présents dans les tissus foliaires et subissaient une forte induction (8 à 10 fois) à la lumière. Disposant de tous les outils moléculaires nécessaires à l'étude de la biogénèse de la GDC, nous avons étudié les modalités de mise en place du complexe au cours du développement de la feuille de pois. Nous avons observé que la capacité d'oxydation des mitochondries de tissus foliaires durant les premiers stades était négligeable pour augmenter de façon dramatique lorsque la feuille était pleinement ouverte (9 jours). En effet, contrairement à la Rubisco qui est présente dans les chloroplastes dès les tout premiers stades du développement, les protéines de la GDC se mettent en place beaucoup plus tardivement au sein de la matrice mitochondriale. Ce chargement en GDC des mitochondries est tellement important qu'il se traduit par une augmentation de leur densité. L'analyse des transcrits des gènes codant pour les protéines de la GDC (P, H et T) et la petite sous unité de la Rubisco révèle qu'ils sont exprimés dès le 4ième jour de croissance, stade où les mitochondries sont incapables d'oxyder la glycine. Cela suggère l'existence d'un contrôle post-transcriptionnel de l'expression des gènes codant pour les protéines P, H et T de la GDC. Nous avons isolé le gène codant pour la protéine T qui est composé de 4 exons et dont la taille approximative est de 3 kpb. Nous avons détecté deux démarrages de transcription dont l'un présente une séquence riche en pyrimidine proche de la séquence Inr (Initiator element). L'analyse de la région promotrice du gène révèle essentiellement trois régions consensus, découvertes chez les gènes nucléaires codant pour la petite sous-unité de la Rubisco et pour la protéine liant les chlorophylles a/b : une région riche en nucléotide AT, un motif GATA en tandem et la boîte II (GGTTAA). Ces séquences semblent être impliquées dans la réponse à la lumière et dans la spécificité tissulaire. L'incubation de la région riche en nucléotides AT et de la boîte II avec un extrait nucléaire provenant de feuilles vertes a permis de caractériser certains facteurs de transcription similaires à ceux présents chez rbcS3,6 et rbcS3A. Dans la perspective de l'étude structurale de la protéine T, nous avons réussi à surexprimer chez E. coli la protéine T, seule ou en tandem avec la protéine H. La présence de nombreux codons rares dans la séquence nucléotidique, nous a amené à construire des vecteurs coexprimant l'ARNt codant pour l'arginine, de façon à permettre la traduction de la protéine dans la bactérie.
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Dates et versions

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  • HAL Id : tel-01011285 , version 1

Citer

Pierre Vauclare. Structure, biogenèse et expression de la protéine T du complexe de la Glycine décarboxylase des plantes supérieures (Pisum sativum). Biologie cellulaire. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 1996. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-01011285⟩
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