Molecular and structural characterization of the GASP family of proteins
Caractérisation moléculaire et structurale de la famille des protéines GASP
Résumé
GPCRs represent one of the most diversified protein families in humans. They translate extracellular stimuli into intracellular signals to modulate a large panel of physiological processes making them unrivalled targets for development of new therapeutic agents. Recently, we identified the GASP family of proteins that interact with GPCRs and modulate the postendocyticfate of agonist activated receptors. GASP-1 is the well-characterized protein of this family and has been shown to be involved in the sorting of receptors that are quickly degraded following agonistpromoted internalization. Although GASP-1 was found to interact with numerous GPCR both in vitro and in vivo and that helix 8 of GPCRs is critically involved in this interaction, little is known about which region within GASP-1 is required for its interaction with GPCRs. In this work, we first present a detailed analysis of the molecular interaction between GASPs and GPCRs. By using biochemical and biophysical experiments we shown that the central domain of GASP-1 is critical for the interaction with GPCRs and that a conserved and repeated sequence of 15 amino acids plays a critical role in this interaction. In a second step, we developed an HTC assay allowing us to identify small molecules able to disrupt the interaction between GASP-1 and the beta-2 adrenergic receptor. Finally, preliminary NMR experiments have confirmed the importance of amino acid tryptophan for the interaction with GPCRs and a first crystallization trials were performed with a fragment of GASP -1.
Les RCPG sont exprimés dans tous types de tissus et sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques et ont pour rôle de capter un vaste panel de stimuli extracellulaires qu’ils transmettent à l’intérieur de la cellule. Récemment, le laboratoire a identifié une nouvelle famille de dix protéines, les GASP, qui interagissent avec les RCPG et moduleraient leur trafic intracellulaire. Alors que GASP-1 est le membre de cette famille le mieux caractérisé et que son interaction avec de nombreux RCPG soit documentée, peu d’informations sont disponibles sur les modalités d’interaction de cette protéineavec les RCPG au niveau moléculaire. La première partie de ce projet de thèse a consisté à étudier les modalités d’interaction entre les GASPs et les RCPG au niveau moléculaire. Nous avons ainsi pu montrer à l’aide de techniques biochimiques et biophysiques, l’importance d’un motif répété et conservé de 15 acides aminés pour l’interaction de GASP-1 avec divers RCPG. Par la suite, les résultats obtenus ont été exploités pour mettre en place un essai de criblage qui nous a permis d’identifier des petites molécules capables de perturber l’interaction entre GASP-1 et le récepteur beta-2 adrénergique. Enfin, l’absence de données structurales sur les protéines de la famille GASP nous a ensuite poussé à la réalisation d’études structurales de ces protéines à la fois par cristallographie et par RMN. Bien que les résultats obtenus ne nous aient pas encore permis d’obtenir la structure de ces protéines, des expériences préliminaires de RMN ont permis deconfirmer l’implication des acides aminés tryptophanes présents au sein des motifs GASP dans l’interaction avec les RCPG.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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