Experimental study of biofilm formation under controlled hydrodynamic conditions
Etude expérimentale de la formation des biofilms sous conditions hydrodynamiques contrôlées
Résumé
In the aquatic environment, 90% of microorganisms are present as a biofilm rather than free-swimming cells. Biofilms may develop on most of humid surfaces, in particular, in porous media for their high specific surface area. Biofilm formation in porous media is very interesting subject for many scientific researchers, because of its relevance to many industrial processes such as water treatment, soil bio- mediation, oil recovery and CO2 storage. However, the development of the biofilm is not just a passive aggregation of bacteria cells. It involves biological, physical and chemical interactions with the bacteria’s micro-environment. Several studies in macroscopic scale have shown that hydrodynamic conditions in porous media play an essential role on the dynamics of biofilm growth, which in turn affects hydrodynamic properties of porous media such as porosity, permeability and pressure drop. In this thesis we have developed an experimental device and an appropriate methodology for the characterization of biofilm’s structure. An experimental study on the influence of fluid flow on the formation and structure of biofilms was performed using a bacterial strain Pseudomonas putida. Biofilms were grown in micro Hele-Shaw flow cell (in PDMS or PMMA) under laminar flows (Re=0.04~2) and fed continuously with a nutrient medium. Characterization of initial colonization was also carried out in order to examine the statistical variability and reproducibility of experiments. Biofilm formation on a solid support under a sheared flow (Re=0.04 (0.0021 Pa) and Re = 2 (0.094 Pa)) was evaluated after 24, 48 and 72h of development. Observations were made under a confocal laser scanning microscopes using fluorescent tag. 2D images were taken at different positions in the flow cell and used to perform a 3D reconstruction of biofilm’s structure and an evaluation of its spatial distribution for an observation area of 12 *12mm². The results show that biofilms formation is not sensitive to initial colonization. A stratification of biofilm was also observed. The inner layer has a thin thickness (5~10 µm), but with a dense structure, while the outer layer show rather a filamentous structure. The ratio of volume fractions between these two layers varies from 3 to 12, depending on the formation time. This difference is more important in the case of low shear stress than that of high shear stress, which means that the upper part of the biofilm seems to be controlled by the hydrodynamic conditions. By analyzing the spatial distribution of the biomass, we found that after 48h, the biofilm present a significant heterogeneity and the volume fraction of biomass decreases after 72h for both two hydrodynamic conditions, which suggests probable detachments or erosions of biofilm. Concerning the growth kinetics, different apparent growth rates were observed for each observation time. These values are significantly below the growth rates observed in free culture medium. This result also indicates a possible effect of hydrodynamics on the growth of biofilm. This experimental study of biofilm formation in micro-scale allowed us to obtain the information on the biofilm structural and its apparent growth rate, as well as the hydrodynamic effect on its properties across several pores of the porous media. This scaling up makes it’s possible to develop eventually mathematical models to simulate the evolution biofilm’s morphology and its spatial distribution in the porous medium.
En milieu aquatique, 90% des microorganismes se présentent sous forme de biofilm plutôt que dans un état planctonique. Les biofilms peuvent se former sur la plupart des surfaces humides, en particulier, les milieux poreux en raison de leur grande surface spécifique. La formation du biofilm dans les milieux poreux représente un domaine précieux pour la recherche scientifique en raison de sa pertinence pour de nombreux processus industriels, telles que le traitement des eaux, la bio-médiation des sols, la récupération du pétrole et le stockage du CO2. Cependant, le développement du biofilm n’est pas simplement une agrégation passive de cellules, il implique des interactions biologiques, physiques et chimiques avec le microenvironnement. Les études macroscopiques ont démontré que les conditions hydrodynamiques dans les milieux poreux jouent un rôle décisif sur la dynamique d'accumulation des biofilms, ce qui influence à son tour les propriétés hydrodynamiques comme la porosité, la perméabilité et la chute de pression. Dans cette thèse nous avons mis au point une méthodologie et un dispositif expérimental permettant la caractérisation de la structure d’un biofilm.A partir de cette procédure, une étude expérimentale sur l’influence de l’écoulement sur la formation et la structure des biofilms a été effectuée sur une souche bactérienne Pseudomonas putida. Les biofilms sont développés dans des micros cellules d’écoulement de type Hèle-Shaw (en PDMS ou PMMA) et alimentés en continue avec un milieu nutritif. La caractérisation de la colonisation avant croissance du biofilm a été également réalisée afin de pouvoir caractériser la variabilité statistique et la reproductibilité des expériences. La formation du biofilm sur un support solide dans un écoulement cisaillé a été évaluée après 24h, 48h et 72h de développement pour deux conditions hydrodynamiques, Re=0.04 (0.0021 Pa) et Re=2 (0.094 Pa). Les observations ont été effectuées sous microscope confocal à l’aide de marqueurs fluorescents. Des images 2D sont prises en différentes positions puis sont utilisées pour effectuer une reconstruction 3D du biofilm avec l’évaluation la distribution spatiale sur une zone de 12*12mm². Nous avons ensuite mis en évidence que les biofilms formés sont peu sensibles aux conditions de colonisation initiales. Nous avons également observé une stratification du biofilm selon la hauteur. La couche interne présente une faible épaisseur (5~10 µm) mais avec une structure dense, tant dis que la couche externe présente plutôt une structure filamenteuse. Le rapport des fractions volumiques entre ces deux couches peut varier de 3 jusqu’à 12, selon le temps de formation. Cet écart est autant plus important pour le cas de faible cisaillement que celui de fort cisaillement. Ceci montre que la partie supérieure du biofilm semble être contrôlée par les conditions hydrodynamiques. En analysant la distribution spatiale du biofilm, nous avons constaté une forte hétérogénéité après 48h de développement présente dans la structure, ainsi qu’une diminution de la fraction volumique de la biomasse après 72h, pour les deux conditions hydrodynamiques imposées. Ceci évoque de probables détachements ou des érosions du biofilm. A propos de la cinétique de croissance, on constate un taux de croissance apparent différents pour chaque temps d’observation. Ces valeurs sont largement inférieures aux taux de croissance observé en culture libre. Ce résultat indique également un possible effet de l’hydrodynamique sur la croissance du biofilm. Cette étude nous permet, à partir des mesures à l’échelle microscopique, d’obtenir des informations sur la structure et le taux de croissance apparent du biofilm, ainsi que l’effet de l’hydrodynamique sur ses propriétés à l’échelle de quelques pores. Ce changement d’échelle, permettra à terme de développer des outils pour simuler et/ou modéliser l’évolution de la morphologie et la distribution spatiale d’un biofilm dans un milieu poreux.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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