Regulatory roles of the cytochrome b6f complex in redox sensing and state transitions in Chlamydomonas reinhardtii
Rôles du cytochrome b6f dans la régulation des transitions d'état
Résumé
Sunlight is a powerful but fluctuating energy source used by photosynthetic organisms to power the assimilation of atmospheric CO2 into reduced carbon compounds. To optimize photosynthetic efficiency in ever-changing light conditions, organisms of the green lineage regulate the distribution of energy input between the two photosystems through state transitions. This process is governed by the redox state of the membrane pool of quinones, liposoluble electron carriers. Through a yet unknown mechanism, the cytochrome (cyt) b6f complex detects these redox changes and transmits a signal to the state transition kinase Stt7 for its activation. In order to decipher the role of the cyt b6f, we devised a novel experimental strategy in Chlamydomonas reinhardtii combining the random mutagenesis of a chloroplast gene (petD coding for cyt b6f subunit IV) by error-prone PCR, chloroplast transformation and selection of clones on phototrophic growth. Analysis of variant sequences allowing proper assembly and function of cyt b6f revealed some interesting features on the mutational robustness of this subunit in the context of its large transmembrane protein complex. Transformants were then screened by chlorophyll fluorescence emission imaging on their ability to perform state transitions. Several state transition mutants were isolated, and sequencing revealed that mutations concentrated in the stromal fg loop of subunit IV. Site-directed mutagenesis of key fg loop residues showed that substitutions of Asn122, Tyr124 and Arg125 produced mutants that are blocked in State I independently of the redox state of the PQ pool and with no adverse effects on cyt b6f assembly and electron transfer activity. Protein-protein interaction studies provided evidence that the kinase domain of Stt7 interacts with the subunit IV fg loop and that its autophosphorylation activity depends on Arg125. We propose a model for the interaction between these two proteins as well as for the cyt b6f-mediated mechanism of Stt7 activation.
La lumière du Soleil est une source d’énergie puissante mais fluctuante utilisée par les organismes photosynthétiques pour permettre l’assimilation du CO2 atmosphérique en espèces carbonées réduites. Pour optimiser l’efficacité photosynthétique en conditions de lumière changeantes, les organismes de la lignée verte régulent la distribution de l’excitation lumineuse entre les deux photosystèmes grâce aux transitions d’état. Ce processus est modulé par l’état redox du réservoir membranaire de quinones, des transporteurs d’électrons liposolubles. Par un mécanisme encore inconnu, le cytochrome (cyt) b6f détecte ces changements redox et transmet un signal d’activation à la kinase des transitions d’état, Stt7. Afin de comprendre le rôle du cyt b6f, nous avons mis au point une nouvelle stratégie expérimentale chez Chlamydomonas reinhardtii combinant la mutagénèse aléatoire d’un gène chloroplastique (petD codant pour la sous-unité IV du cyt b6f) par PCR error-prone, la transformation chloroplastique et la sélection des clones sur leur croissance phototrophe. L’analyse des séquences variantes permettant l’assemblage et le fonctionnement du cyt b6f a révélé certaines caractéristiques intéressantes de la robustesse aux mutations de cette sous-unité dans le contexte du complexe protéique transmembranaire auquel elle appartient. Les transformants ont ensuite été criblés par imagerie de l’émission de fluorescence de la chlorophylle sur leur capacité à réaliser des transitions d’état. Plusieurs mutants de transitions d’état ont été ainsi isolés, et le séquençage a révélé que les mutations impliquées étaient concentrées sur la boucle stromale fg de la sous-unité IV. La mutagénèse dirigée de plusieurs résidus clés de la boucle fg a montré que les substitutions des résidus Asn122, Tyr124 et Arg215 généraient des mutants bloqués à l’état I indépendamment de l’état redox du pool de quinones et sans effets défavorables sur l’assemblage et l’activité de transfert d’électrons du complexe. Des expériences d’interaction protéine-protéine ont ensuite servi à prouver que le domaine kinase de Stt7 interagit avec la boucle fg de la sous-unité IV et que son activité d’autophosphorylation dépend du résidu Arg125. Nous proposons un modèle de l’interaction entre ces deux protéines ainsi que du mécanisme d’activation de la kinase médié par le cyt b6f.
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