Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des nanovésicules circulantes (30 à 1000 nm de diamètre) libérées dans l’espace extracellulaire par la plupart des cellules humaines, suite à leur activation ou à leur apoptose. Les VEs se divisent en 3 grandes catégories : les exosomes (EXO), les microparticules (MPs) et les corps apoptotiques (cAPO). Les VEs sont présentes à l’état physiologique dans les différents fluides biologiques du corps humain (plasma, salive, urine, etc.) et jouent un rôle majeur dans différents processus physio-pathologiques. De nos jours, plusieurs techniques, dont certaines en routine, sont utilisées pour étudier les VEs. Cependant, aucune d’entre elles ne permet de déterminer à la fois leur concentration, leur taille et leurs caractéristiques biochimiques. Un consensus existe sur la nécessité de combiner des techniques pour disposer enfin d’une caractérisation fine et complète des VEs. Il est donc d’un intérêt majeur de développer des plateformes analytiques pour améliorer la qualification des échantillons biologiques et découvrir, au sein de sous-populations vésiculaires, de nouveaux biomarqueurs de pathologies humaines ou bio-indicateurs de suivi thérapeutique. Notre projet consiste à développer une plateforme NanoBioAnalytique (NBA) combinant trois techniques : l’imagerie par Résonance des Plasmons de Surface (SPRi), la Microscopie à Force Atomique (AFM) et la Spectrométrie de Masse (MS). L’enjeu est de valider une interface biopuce-instruments qui permettra d’effectuer des investigations multi-physiques et multi échelles apportant, en une stratégie globale, les informations les plus complètes sur les différentes populations de VEs. La technique SPRi représente la première étape analytique en permettant la capture spécifique des VEs en format multiplex. Cette capture sélective est le résultat d’une architecture de biopuce présentant (i) différents biorécepteurs spécifiques immobilisés en spot et (ii) une surface biofonctionnalisée limitant les interactions non spécifiques au contact d’échantillons biologiques complexes. La SPRi permet de suivre le taux de capture et de quantifier les vésicules extracellulaires sur les différentes zones de biorécepteurs, en temps réel et sans marquage. A partir de ces biopuces à VEs, différentes investigations peuvent être menées pour parfaire leur caractérisation. L’une d’entre elle consiste en la caractérisation nano-métrologique par AFM (taille, morphologie, dénombrement...) des VEs sélectivement capturées. L’AFM dispose d’une résolution telle qu’elle permet de discriminer des vésicules uniques jusqu’aux agrégats (protéiques, vésiculaires), conduisant ainsi à une caractérisation précise des différentes sous-populations de VEs. Le couplage SPRi-AFM a été adapté pour simplifier l’imagerie des différentes zones de biorécepteurs, avoir une vue globale représentative de la surface et mesurer la taille de milliers de particules individuelles. Une autre possibilité porte sur une interrogation de la biopuce par spectrométrie de masse (MS) qui permet de générer une signature protéomique spécifique des VEs capturées. Cette stratégie permet une analyse protéomique sélective de VEs, ce qui permet de mieux caractériser les différentes sous-populations de VEs et mieux comprendre les mécanismes exacts impliqués dans leur biogenèse et leurs fonctions biologiques. Le développement d’outils et de méthodes pour le dosage et la métrologie de particules nécessite une étape de calibration, et, pour cela, nous avons mis au point des calibrants internes. Ici, deux calibrants couvrant le domaine de taille des VEs ont été développés: (i) des particules virales CP50 (diamètre moyen de 50 nm), et (ii) des particules synthétiques CP920 biofonctionnalisées par la protéine LAG-3 (diamètre de 920 nm). Les tests d’immuno-capture des calibrants en SPRi ont montré une grande spécificité avec une gamme dynamique de 107 à 1012 particules/mL et sans interférence avec les milieux biologiques. Nous avons démontré que cette gamme recouvrait la gamme de concentrations physiologiques en VEs des 3 projets collaboratifs que comporte cette étude. D’autre part, l’interrogation in-situ des calibrants sur biopuce par l’AFM a pu être mise en place et conduire à leur analyse nanométrologique. Ainsi, la densité des particules calibrants à la surface de la puce, déterminée par AFM, a été corrélée avec le taux de capture de ces dernières déterminé par SPR. Dans un deuxième temps, nous avons éprouvé notre plateforme NBA vis-à-vis de différents échantillons naturels de VEs issus de deux collaborations : (i) un projet avec une équipe INSERM (U1098, EFS Bourgogne Franche-Comté, Besançon, France) qui s’intéresse à l’exploitation du rôle des VEs plaquettaires (PVEs) générées sous différentes conditions dans la modulation de la réponse inflammatoire. Dans ce cas, la plateforme NBA a été utilisée pour la caractérisation des VEs générées à partir des plaquettes dans leur état basal et des VEs libérées par les plaquettes suite à leur activation par du collagène. (ii) Une collaboration avec le professeur T. Burnouf (Université de Médecine de Taipei, Taiwan) qui vise à mieux comprendre l’effet des VEs sur les patients dans le cadre de la transfusion sanguine et d’explorer comment la nanofiltration du plasma pourrait diminuer le risque de thrombogénicité. L’équipe du professeur Burnouf a mis en évidence le rôle des PVEs générées sous différentes conditions, en particulier dans l’induction de l’agrégation des cellules monocytaires et de la libération des VEs exprimant le facteur tissulaire par ces dernières. L’impact de la nanofiltration du plasma sur l’élimination d’une partie de VEs plasmatiques et la diminution de risque de thrombogénicité in-vitro est également un objectif poursuivi. Dans ce cadre, la plateforme NBA a été utilisée dans un premier temps pour comparer les PVEs d’origine plaquettaire, qu’elles soient basales ou activées à la thrombine. Ensuite, l’objectif était de comparer le contenu en VEs dans des échantillons de plasma ayant subi ou non une étape de nanofiltration à travers un filtre de 75 nm. Ces travaux ont montré la capacité de notre plateforme à détecter sélectivement différentes sous-populations de VEs co-existantes dans un échantillon complexe, tel que le plasma, en s’appuyant sur l’expression différentielle de 6 marqueurs membranaires simultanément. Les taux de capture se sont avérés être directement corrélés à la concentration des vésicules dans l’échantillon injecté. L’analyse AFM a permis de déterminer la distribution en taille de différentes sous-populations de VEs sur la gamme de 20 à 1000 nm. Cette analyse montre que la majorité des vésicules (≈ 98%) sont inférieures à 300 nm avec une population majeure (≈ 80%) en dessous de 100 nm. De plus, une analyse différentielle a permis de révéler une distribution en taille reliée aux conditions de leur genèse (ex. état basales ou activées) mais aussi impactée par les protocoles de préparation des échantillons (ex. nanofiltration). Enfin, des études protéomiques « sur-puce » ont également été engagées afin de caractériser la composition en protéines des VEs libérées sous différentes conditions. Cette analyse de grande sensibilité (<1μg de protéines totales) a permis d’établir des premiers profils protéomiques différentiels des VEs, permettant l’identification de centaines de protéines du « vésiculome ». La plateforme NBA se révèle être une méthode efficace pour caractériser et quantifier les VEs, sans-marquage et avec une grande sensibilité, sur une large gamme dynamique (≈107 à 1012 particules/mL), cohérente avec celle existante en fluide physiologique et sur une plage de taille couvrant deux décades. Elle s’inscrit parmi les approches les plus prometteuses pour l’investigation des VEs, en complément de la cytométrie en flux. La grande adaptabilité de cette méthode d’analyse des VEs ouvre de larges perspectives de déploiement dans les secteurs de la Santé, de l’Environnement et de l’Agro-alimentaire.