Structural studies of the 5-HT3 receptor
Etudes structurales du récepteur 5-HT3
Résumé
Cys-loop receptors are pentameric ligand-gated ion channels (pLGIC), which play a crucial role in rapid neurotransmission. They are the targets of a legion of drugs (antiemetics, general anesthetics, benzodiazepines, smoke cessation drugs, etc.) and their physiological properties are intensively studied. When pLGICs bind neurotransmitters, they undergo conformational changes, from a resting closed-pore state to a transient open-pore state; they can also enter a ligand-bound, closed-pore, desensitized state. Moreover, the gating properties of pLGICs can be influenced by a variety of compounds (e.g. lipids, competitive inhibitors, allosteric modulators, ions such as Ca2+), which makes them flexible receptors capable of integrating different signals into conformational changes.In this thesis we focus on structural studies of the mouse serotonin type 3 receptor (m5-HT3R). The first structure of the m5-HT3R, obtained by X-ray crystallography using stabilizing nanobodies, was a closed-pore inhibited conformation {Hassaine:2014de}. As a follow-up, we aimed to obtain structures of the m5-HT3R in other conformations, in order to elucidate its gating mechanism. For this purpose we used both X-ray crystallography and cryo-electron microscopy and thus the whole thesis follows two story-lines.A general introduction of the pLGIC family is followed by a detailed structural description of the m5-HT3R. In the results section, we present the optimized protocol for the receptor purification, we report that limiting diffraction is a bottleneck in the crystallographic trials and we emphasize limits met using nanobodies for conformational stabilization of the receptor. In the electron microscopy results part we present the optimization of the sample and grid preparation that ultimately permitted data collection. We report four different structures representing distinct functional states of the m5-HT3R: an inhibited tropisetron-bound closed conformation, an open-pore state and a putative pre-active state obtained in the presence of serotonin, and finally a closely-related putative pre-active state in the presence of serotonin and of the allosteric modulator TMPPAA. We compare our data with structures of the same receptor obtained by other laboratory.It was shown for the first time in our work how the antagonist (tropisetron) and the neurotransmitter (serotonin) bind to the full-length m5-HT3R. And our structures deepen the knowledge of the receptor's gating mechanism.
Les récepteurs Cys-loop sont des canaux ioniques pentamériques activés par un ligand (pLGIC), qui jouent un rôle essentiel dans la neurotransmission rapide. Ils sont la cible de nombreuses familles de médicaments (antiémétiques, anesthésiques généraux, benzodiazépines, médicaments pour arrêter de fumer, etc.) et leurs propriétés physiologiques sont, en conséquent, très étudiées. Lorsque les pLGIC lient des neurotransmetteurs, ils subissent des modifications conformationnelles, d’un état au repos où le pore est fermé vers un état transitoire ouvert. La liaison de ligand peut également provoquer un état conformationnel fermé et désensibilisé. En outre, les propriétés des pLGIC peuvent être influencées par divers composés (lipides, inhibiteurs compétitifs, modulateurs allostériques, ions tels que Ca2 +), ce qui en fait des récepteurs capables d'intégrer différents signaux via des changements de conformation.Dans cette thèse, nous nous concentrons sur des études structurales du récepteur de la sérotonine de type 3 chez la souris (m5-HT3R). La première structure du m5-HT3R, obtenue par cristallographie aux rayons X, représentait une conformation inhibée à pore fermé, stabilisée par des nanobodies {Hassaine: 2014de}. Nous avons cherché à obtenir des structures dans d’autres conformations, afin d’élucider son mécanisme moléculaire de fonctionnement. Pour ce faire, nous avons utilisé à la fois la cristallographie aux rayons X et la cryo-microscopie électronique. Les résultats obtenus sont décrits dans 2 chapitres dédiés de la thèse.Une introduction générale de la famille pLGIC est suivie par une description détaillée de la structure du m5-HT3R. Dans la section résultats, nous présentons le protocole optimisé pour la purification du récepteur, nous expliquons que la mauvaise diffraction est un facteur limitant dans les essais cristallographiques, et nous montrons les freins rencontrés lors de l'utilisation des nanobodies pour la stabilisation conformationnelle du récepteur. Dans les résultats de la microscopie électronique, nous présentons l'optimisation de la préparation de l'échantillon et de la grille qui a finalement permis la collecte de données. Nous décrivons quatre structures différentes représentant des états fonctionnels distincts du m5-HT3R : une conformation inhibée fermée liée au Tropisétron ; un état ouvert et un état pré-actif présumé obtenus en présence de sérotonine ; et enfin un état proche de l’état pré-actif supposé, en présence de sérotonine et du modulateur allostérique TMPPAA. Nous comparons nos données avec les structures du même récepteur obtenues par un autre laboratoire.Notre travail a montré pour la première fois comment l'antagoniste (Tropisétron) et le neurotransmetteur (sérotonine) se lient au m5-HT3R. Nos structures approfondissent également la connaissance du mécanisme d’action du récepteur.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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