Multimodal and Advanced Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy for an Improved Characterization of Biopolymers in Cells and Tissues
Microscopie de Génération de Seconde Harmonique Multimodale et Interférométrique pour une Caractérisation Améliorée des Biopolymères dans les Cellules et Tissus
Résumé
Multiphoton microscopy is a paramount paradigm for tissue imaging and characterization in biology,
and more generally in material sciences. Within it, second harmonic generation (SHG) has become the
gold standard for in-situ 3D visualization of tissues containing a widespread biopolymer: fibrillar collagen.
SHG’s intrinsic properties, being the result of a highly coherent exciting wave being inelastically scattered,
allows these types of materials to be specifically revealed, among which are also myosin in muscles, and
various nonlinear crystals.
However, the optical coherence of SHG also means that the images contain the result of complex
interferences, and not the actual structure of the material. Partly because of this problem, many
techniques have been proposed to enhance SHG, and to fully benefit of its numerous properties: the
direction of generation can be probed, its sensitivity to polarization, or its relative phase.
Interferometric Second-Harmonic Generation microscopy (I-SHG), and its application to biological
tissues, have allowed for the relative phase to be measured. This technique has been increasingly better
controlled, but lacked a real incorporation with other multiphoton techniques. It was also quite long and
complicated to use, and measured only the phase, without taking advantage of other parameters.
This dissertation first portrays the general context around SHG, before detailing the process itself.
Directional and polarization-resolved SHG are then presented and applied to the analysis of a complex
collagen-rich tissue: the equine meniscus in a joint. A property of Gaussian beams being focused, the
Gouy phase-shift, which explains some SHG imaging artifacts in stacked structures, is then reported to
be measurable with I-SHG’s phase retrieval. Afterwards, I-SHG was used to decouple these artefactual
interferences from the real structure of samples containing alternating polarities, while also enhancing
the structure’s visibility.
I-SHG was subsequently made compatible with laser-scanning schemes, which greatly enhanced its
speed. This was applied to in-situ imaging of the microtubules’ polarity during an embryo mitosis.
Because this "fast I-SHG" still presented some experimental latencies, a single-scan paradigm (1S-ISHG)
was implemented, using an electro-optic modulator that changes the relative phase of the interferograms
within the conventional pixels of the image. The complete optical, hardware and software controls
required for these improvements are detailed as well.
This one order of magnitude speed enhancement remains to be utilized to characterize dynamic
processes requiring an imaging speed below the Hz scale, or for large-scale studies. Menisci could also
be further investigated in multimodal microscopy coupled to I-SHG.
La microscopie multiphoton est primordiale pour l’imagerie des tissus biologiques et de certains matériaux.
La Génération de Seconde Harmonique (SHG) est en particulier une référence pour l’imagerie 3D
des tissus contenant un biopolymère très répandu: le collagène. Les propriétés intrinsèques de la SHG,
qui résulte de la diffusion inélastique d’une onde excitatrice très cohérente, permettent de révéler spécifiquement
ce type de structures, parmi lesquelles figurent aussi la myosine des muscles, ou certains
cristaux non-linéaires.
Cependant, la cohérence optique de la SHG signifie également que les images contiennent la résultante
d’interférences complexes, et non la structure réelle du matériau. Pour cela, de nombreuses techniques
ont été proposées pour améliorer la SHG, et tirer pleinement parti de ses nombreuses propriétés: la
direction de la génération, sa sensibilité à la polarisation ou sa phase relative peuvent être sondées. La
microscopie de Génération de Seconde Harmonique Interférométrique (I-SHG), et son application aux
tissus biologiques, a permis de mesurer la phase. Cette technique a été de mieux en mieux maîtrisée,
mais sans être réellement intégrée à d’autres techniques multiphoton. Elle était aussi assez longue et
compliquée à utiliser, et ne mesurait que la phase, sans tirer parti d’autres paramètres.
Cette thèse présente d’abord le contexte général autour de la SHG, avant de détailler cette dernière.
La SHG directionnelle et résolus en polarisation sont ensuite utilisées pour l’analyse du collagène d’un
tissu complexe: le ménisque des articulations équines. Une propriété des faisceaux Gaussiens subissant
une focalisation, le déphasage de Gouy, est ensuite démontrée mesurable par I-SHG. Cette dernière
explique notamment certains artefacts d’imagerie par SHG dans des structures en empilement. Ensuite,
ces interférences artéfactuelles sont découplées par I-SHG de la structure réelle dans des échantillons
contenant des alternances de polarité, ce qui produit aussi une meilleure visibilité de la structure.
La I-SHG est ensuite rendue compatible avec un balayage laser, ce qui améliore considérablement
sa vitesse. Ceci est appliqué à l’imagerie in situ de la polarité des microtubules au cours d’une mitose
embryonnaire. Puisque cette "I-SHG rapide" présentait encore quelques latences expérimentales, elle
a été ensuite réduite à un seul balayage de l’échantillon (1S-ISHG), via un modulateur électro-optique
qui déphase les interférogrammes au sein même des pixels de l’image. Le contrôle optique, matériel et
logiciel nécessaire à ces améliorations sont également détaillés.
Cette amélioration de la vitesse (un ordre de grandeur) pourra servir à caractériser des processus dynamiques,
ou pour des études à grande échelle. Le ménisque pourra également bénéficier d’un couplage
microscopie multimodale - ISHG.
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