Nuclear organization and regulation of gene expression in mouse Embryonic Stem Cells by long non-coding RNAs - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2018

Nuclear organization and regulation of gene expression in mouse Embryonic Stem Cells by long non-coding RNAs

Organisation nucléaire et régulation d’expression des gènes dans les cellules souches embryonnaires murines par les longs ARN non-codants

Résumé

The nucleus is a highly structured organelle and long non-coding RNAs (lncRNAs) have been shown to be involved in nuclear organization by establishing and maintaining nuclear compartmentalization, by the formation of subnuclear domains or the establishment of long range interactions in the nuclear space. A robust approach for the identification of “nuclear organizers” molecules is currently lacking though. We established an experimental approach that would allow us to identify such “structural” lncRNAs on a genome-scale level. Based on the biochemical property of some nuclear organizing lncRNAs to resist the so called nuclear matrix preparation, where DNA and soluble molecules are largely removed, we performed nuclear matrix preps on mouse Embryonic Stem Cells (mESCs), purified the RNA fraction and explored its constituents by RNA-seq. We identified a subset of transcripts (non-extracted RNAs, nextRNAs) potentially involved in the functional organization of the nucleus. Notably, we detected previously non-annotated transcripts with our original RNA-seq datasets and focused our work on two of them: NextC1 (Next Candidate 1) and 2. We characterized them on a functional and phenotypical level by monitoring their expression profile in different culturing conditions and embryo-derived cell types. Their subcellular localization was assessed by RNA-FISH. Loss- and gain-of-function assays were performed targeting their promoter regions with the CRISPR/Cas9 system for genome editing and CRISPR-derived systems for transcription inhibition or activation. Many of these functional assays were subsequently RNA-sequenced and an integrative data analysis is currently ongoing.
Le noyau est extrêmement structuré et il a été démontré que les longs ARN non-codants (lncRNAs) sont impliqués dans l'organisation nucléaire en établissant la compartimentation nucléaire, par les domaines sous-nucléaires ou des interactions à longue portée dans l'espace nucléaire. Une approche robuste pour l'identification de telles molécules fait toutefois défaut. Nous avons mis en place une approche expérimentale permettant d'identifier les lncRNAs «structurels» à l'échelle du génome. Basé sur la propriété biochimique de certains lncRNAs à résister l’extraction de la matrice nucléaire, quand l’ADN et les molécules solubles sont enlevés, nous avons effectué des préparations de matrice nucléaire en utilisant des cellules souches embryonnaires murines, purifié la fraction d’ARN et exploré ses constituants par RNA-seq. Nous avons identifié des transcrits (non-extracted RNAs, nextRNAs) potentiellement impliqués dans l'organisation fonctionnelle du noyau. Nous avons notamment détecté des transcrits précédemment pas annotées et axé notre travail sur deux gènes: NextC1 (Next Candidate 1) et 2. Nous les avons caractérisées au niveau fonctionnel et phénotypique en explorant leur profil d’expression dans différents contextes de culture et lignées cellulaires dérivées de l'embryon. Leur localisation subcellulaire a été évaluée par RNA-FISH. Des analyses de perte et de gain de fonction ont été effectuées en ciblant leurs régions promotrices avec le système CRISPR/Cas9 et les systèmes dérivés de CRISPR pour l'inhibition ou l'activation de la transcription. Nombreuses de ces analyses fonctionnelles ont ensuite été soumis à RNA-seq et une analyse de données intégrative est en cours.
Fichier principal
Vignette du fichier
these_tachtsidi_alexandra_2018.pdf (11.51 Mo) Télécharger le fichier
Origine Version validée par le jury (STAR)
Loading...

Dates et versions

tel-02924993 , version 1 (28-08-2020)

Identifiants

  • HAL Id : tel-02924993 , version 1

Citer

Alexandra Tachtsidi. Nuclear organization and regulation of gene expression in mouse Embryonic Stem Cells by long non-coding RNAs. Genomics [q-bio.GN]. Sorbonne Université, 2018. English. ⟨NNT : 2018SORUS444⟩. ⟨tel-02924993⟩
98 Consultations
197 Téléchargements

Partager

Gmail Mastodon Facebook X LinkedIn More