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Theses Year : 2020

Cryo-EM characterisation of an enterobacterial stress response system

Caractérisation d'un système entérobactérien de réponse au stress par cryo-EM

Matthew Jessop

Abstract

The field of electron microscopy has undergone rapid transformation in the past few years. It has become one of the most powerful techniques for investigating macromolecular complexes, providing unprecedented structural insights into the fundamental processes of cellular life. In this thesis, I use cryo electron microscopy and negative stain electron microscopy to investigate two biological systems. The first is an enterobacterial protein triad formed of the E. coli proteins LdcI, involved in the acid stress response, and RavA and ViaA, which sensitise E. coli to aminoglycosides. I show that the AAA+ ATPase RavA exists in two distinct conformational states, shedding insight into its ATPase mechanism and revealing unexpected mechanistic similarities to the well-characterised unfoldase ClpX. I also explore the effects of fluorescent protein tags on the structure and function of LdcI, in order to facilitate super-resolution fluorescence microscopy. The second complex is the mitochondrial Complex I assembly complex, which is composed of ACAD9, ECSIT and NDUFAF1 and is involved in the maturation of respiratory Complex I in mitochondria. I investigate the ACAD9-ECSIT-CTD subcomplex using cryo-EM, providing insights into the structure of ACAD9, the location of the ECSIT-CTD binding site and the release of the FAD cofactor of ACAD9 upon ECSIT-CTD binding. Finally, in conjunction with biochemical and biophysical analysis, I place the structural information presented in this thesis in a biological context and lay a platform for future studies of both protein complexes.
Le domaine de la microscopie électronique a connu une transformation rapide au cours des dernières années. Elle est devenue l'une des techniques les plus puissantes pour l'étude des complexes macromoléculaires, fournissant des informations structurales sans précédent sur les processus fondamentaux de la vie cellulaire. Dans cette thèse, j'utilise la cryo-microscopie électronique et la microscopie électronique à coloration négative pour étudier deux systèmes biologiques. Le premier est une triade de protéines entérobactériennes formée de la protéine LdcI de E. coli, impliquée dans la réponse au stress acide, et RavA et ViaA, qui sensibilisent E. coli aux aminoglycosides. Je montre que l'ATPase AAA+ RavA existe dans deux états conformationnels distincts, ce qui permet de mieux comprendre son mécanisme d'ATPase et révèle des similarités mécanistiques inattendues avec l’unfoldase ClpX bien caractérisée. J'explore également les effets des marqueurs de protéines fluorescentes sur la structure et la fonction de LdcI, afin de faciliter la microscopie à fluorescence à super-résolution. Le second complexe est le complexe d'assemblage du Complexe I mitochondrial, qui est composé d'ACAD9, d'ECSIT et de NDUFAF1 et qui est impliqué dans la maturation du Complexe respiratoire I chez les mitochondries. J'étudie le sous-complexe ACAD9-ECSIT-CTD à l'aide de la cryo-EM, ce qui me permet de mieux comprendre la structure d'ACAD9, l'emplacement du site de liaison d'ECSIT-CTD et la libération du cofacteur FAD d'ACAD9 lors de la liaison d'ECSIT-CTD. Enfin, en conjonction avec l'analyse biochimique et biophysique, je place les informations structurales présentées dans cette thèse dans un contexte biologique et je pose une base pour les études futures des deux complexes protéiques.
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Dates and versions

tel-03187407 , version 1 (01-04-2021)

Identifiers

  • HAL Id : tel-03187407 , version 1

Cite

Matthew Jessop. Cryo-EM characterisation of an enterobacterial stress response system. Human health and pathology. Université Grenoble Alpes [2020-..], 2020. English. ⟨NNT : 2020GRALV004⟩. ⟨tel-03187407⟩
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