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Theses Year : 2021

Integration of planktonic bacteria in the biofilm and functional analysis of the Bthur62720 gene in Bacillus thuringiensis

Intégration des bactéries planctoniques dans le biofilm et étude fonctionnelle du gène plasmidique Bthur62720 chez Bacillus thuringiensis

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Abstract

Bacillus thuringiensis is able to produce a pellicle at the air-liquid interface in glass tubes under static conditions. During biofilm formation, two populations coexist: a sessile floating population and a planktonic population, located in the culture medium beneath the pellicle. Using spectrophotometric measurements, we followed the growth of both populations during the B. thuringiensis 407 pellicle formation. Our results show that while the biofilm biomass increases rapidly, the planktonic population growth drops sharply. This decrease is not observed with the 407 spoOA mutant or for strains unable to form a biofilm, and cannot be attributed to cell lysis or cell sedimentation. Therefore, it is the result of a massive integration of planktonic cells in the preformed pellicle. We also visualized, using epi-fluorescence microscopy, the integration of planktonic bacteria of the 407 strain in its preformed biofilm. The recruited cells are located in restricted areas of the biofilm, where the density of sessile cells is low, revealing a heterogeneous spatial distribution of the immigrant cells within the biofilm. To identify the mechanisms involved in the recruitment of planktonic cells in the biofilm, we screened a bank of mutants of the 407 strain, obtained by random mutagenesis, for their ability to integrate a pre-existing biofilm. One of the mutants in the library is strongly affected in its ability to integrate a biofilm. This deficiency is caused by the disruption of the Bthur62720 gene, which is carried by the BTB-9p plasmid and encodes a 21 kDa protein. This protein has no homolog and in silico analysis predict a signal peptide, a N-terminal domain of unknown function and a C-terminal membrane domain. Using immunocytochemistry and translational fusion assays with GFP, we showed that this protein is parietal, polar and that its N-terminal domain is cytoplasmic. With a specific dye of charged membrane phospholipids, 10-N-nonyl acridine orange, we showed that the deletion of Bthur002_62720 disorganizes the lipid rafts distribution, which appear essentially polar in wild type strain 407. Moreover, this deletion strongly affects linear swimming, but not bacterial tumbling or the presence of flagella. These results allow us to hypothesis that Bthur62720 stabilizes the lipid rafts located at the cell poles. The polar localization of these rafts, required for the clustering of chemoreceptors, would be necessary to ensure a normal chemotaxis function and thus, bacterial swimming.
Bacillus thuringiensis est capable de former un biofilm à l’interface air-liquide dans des tubes en verre en condition statique. Pendant la formation du biofilm, deux populations coexistent : une population sessile qui flotte sur le milieu de culture et une population planctonique, située dans le milieu de culture sous la pellicule. En utilisant des méthodes spectrophotométriques, nous avons suivi l’évolution de la croissance des bactéries planctoniques et du biofilm de la souche B. thuringiensis 407. Les résultats obtenus montrent qu’au moment où la biomasse sessile augmente rapidement, la population planctonique chute brutalement et descend jusqu’à une valeur proche de zéro. Cette chute de la population planctonique n’est pas observée avec le mutant spoOA de la souche 407 ou avec des souches incapables de former un biofilm, et ne peut pas être attribuée à la sédimentation ou à la lyse cellulaire. Elle est donc consécutive à un recrutement massif des cellules planctoniques par le biofilm en formation. Nous avons visualisé, par microscopie à epi-fluorescence, l’intégration des bactéries planctoniques de la souche 407 dans son biofilm préformé. Les bactéries recrutées sont localisées dans des zones restreintes du biofilm, où la densité des cellules sessiles est faible, ce qui révèle une distribution spatiale hétérogène des cellules immigrantes au sein du biofilm. Pour identifier les mécanismes impliqués dans le recrutement des cellules planctoniques dans le biofilm, nous avons criblé une banque de mutants de la souche 407 obtenus par mutagenèse aléatoire, pour leur capacité à intégrer un biofilm pré-existant. L’un des mutants de la banque, fortement affecté dans sa capacité à intégrer un biofilm, est touché dans le gène Bthur62720. Celui-ci est porté par le plasmide BTB-9P et code pour une protéine de 21 kDa. Cette protéine est sans homologue, et présente un peptide signal, un domaine N-terminal de fonction inconnue et un domaine C-terminal membranaire. En utilisant deux méthodes, l’immunocytochimie et la fusion traductionnelle avec la GFP, nous avons montré que cette protéine est pariétale, polaire et que son domaine N-terminal est cytoplasmique. A l’aide d’un marqueur des phospholipides chargés, le 10-N-nonyl acridine orange, nous avons montré que la délétion de Bthur62720 désorganise la distribution des radeaux lipidiques, qui apparaissent essentiellement polaires chez la souche 407 sauvage. De plus, cette délétion affecte fortement la nage linéaire, mais pas la culbute, ni la présence de flagelles. Ces résultats nous permettent de formuler l’hypothèse que Bthur62720 stabilise les radeaux lipidiques aux pôles. La localisation polaire de ces radeaux, en permettant la formation des complexes de chémorécepteurs, serait nécessaire pour assurer la nage linéaire.
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  • HAL Id : tel-03200788 , version 1

Cite

Nay El Khoury. Intégration des bactéries planctoniques dans le biofilm et étude fonctionnelle du gène plasmidique Bthur62720 chez Bacillus thuringiensis. Bactériologie. Université Paris-Saclay; Université Saint-Joseph (Beyrouth), 2021. Français. ⟨NNT : 2021UPASL014⟩. ⟨tel-03200788⟩
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