Advanced multiphoton imaging strategies to study rapid periodic processes in vivo : from motile cilia to beating heart
Stratégies avancées d'imagerie multiphoton pour l'étude de processus périodiques rapides in vivo : des cils motiles au cœur battant
Résumé
Oscillations are abundant at every scale of the living world. In development biology, the beating heart and the motile cilium are two oscillators operating at temporally and spatially analogous scales. Their dynamic visualization is a major experimental challenge, which would shed new lights on the biological processes they are involved in. In this manuscript, we will extract their biophysical features or image their three-dimensional beating pattern in vivo, in a vertebrate model organism: the zebrafish. To circumvent current limitation in imaging speed, we will use the common periodic property of their motion to develop innovative strategies for fast multiphoton imaging.First, the cellular cilium is a cytoplasmic extension found in almost all eukaryotic cells whose role is to generate a biological flow when motile. In recent years, their dysfunctions have been identified to be involved in a growing number of pathologies, known as ciliopathies. In particular, they are present in large numbers in the zebrafish left-right organizer, the Kupffer vesicle: the directional flow they generate is responsible, at early stages, for the breaking of the left-right symmetry, the last biological axis to specify in vertebrates. In this manuscript, we will describe a systematic approach to extract cilia biophysical features, using the scanning artifacts observed in point scanning multiphoton microscopy when imaging their periodic beating. The systematic worfkflow we developed has enabled us to unveil the establishment of a novel form of asymmetry in the Kupffer's vesicle.Similarly, the study of the beating heart and the visualization of its rapid and three-dimensional periodic motion remains a challenge, even using state-of-the-art fluorescence microscopy techniques. In this work, we will propose a fast point-scanning imaging method that takes advantage of the periodic property of the beating heart. It relies on the retrospective synchronization of fast scanned line sequences. We will show how this approach can reach unprecedented temporal resolutions (in the order of 1000 volumes per second), with label-free contrast, and without compromising any other acquisition parameters, such as SNR or spatial resolution. In particular, we applied the method to the tracking of contracting cardiac sarcomeres in vivo, using second harmonic generation (SHG), and achieved reconstruction the 3D motion of the cardiac valves, the fastest-moving structure of the heart.
Les oscillateurs biologiques régissent le monde vivant à toutes les échelles. En biologie du développement, le cœur battant et les cils motiles en sont deux représentations dont les dimensions temporelles et spatiales sont analogues. Leur observation dynamique est un enjeu majeur pour permettre la compréhension de leur fonctionnement et des processus biologiques dans lesquels ils sont impliqués. Dans ce manuscrit, nous nous proposons de résoudre leur mouvement tridimensionnel in vivo chez un organisme-modèle de vertébré : le poisson-zèbre. Pour contourner les limites actuelles de vitesse d’imagerie, nous utiliserons la propriété de périodicité de ces oscillateurs biologiques, afin de développer des stratégies innovantes d'imagerie rapide en microscopie multiphoton.D’abord, le cil cellulaire est une extension cytoplasmique que l’on retrouve dans presque toutes les cellules eucaryotes dont le rôle est de générer un flux biologique lorsqu'il est motile. Au cours des dernières années, leurs dysfonctionnements ont été identifiés dans un nombre croissant de pathologies, regroupées sous le terme de ciliopathies. En particulier, ils sont présents en nombre dans l’organisateur gauche-droite du poisson-zèbre, la vésicule de Kupffer. Le flux directionnel qu’ils génèrent est responsable de la brisure de symétrie gauche-droite aux stades précoces, le dernier axe biologique à se spécifier chez les vertébrés. Dans ce manuscrit, nous détaillons une approche systématique d’analyse des cils cellulaires, exploitant les artefacts de balayage observés en microscopie multiphoton, issus du battement périodique de ceux-ci. Cette approche nous a notamment permis de découvrir une nouvelle forme d’asymétrie, ou de chiralité, apparaissant au sein de la vésicule de Kupffer.Par ailleurs, l’étude du cœur battant se heurte également à l’impossibilité de résoudre son mouvement rapide et en trois dimensions, par les techniques actuelles de microscopie. Dans ces travaux, nous proposons une méthode d’imagerie rapide à balayage point par point tirant profit de la propriété périodique du cœur, consistant en la synchronisation a posteriori de séquences de lignes balayées rapidement. Nous montrons que cette approche nous permet d’atteindre des résolutions temporelles sans précédent (de l’ordre de 1000 volumes par seconde), sans marquage, et sans compromettre d’autres paramètres d’acquisition (RSB, résolution spatiale, phototoxicité). En particulier, nous appliquons la méthode au suivi de la contraction des sarcomères cardiaques in vivo par génération de seconde harmonique (SHG), ainsi qu’à l’observation des valves cardiaques, les structures les plus dynamiques du cœur.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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