Study and fabrication of a magneto-fluidic microdevice for the capture and fluorescence detection of model cytokines TNF-α
Etude et réalisation d’un microdispositif magnéto-fluidique pour la capture et la détection de cytokines modèles TNF-α en fluorescence
Résumé
Pro-inflammatory cytokines are molecules involved in several pathologies (cancer, depressive disorders, CoViD-19, …) and found in various biological fluids (blood, sweat, saliva…). Developing a biosensor that could identify and quantify cytokines in these fluids represents an innovative approach for the monitoring of pro-inflammatory pathologies. In this context, the objective of this thesis has been to develop a microfluidic device integrating functionalized magnetic beads for the capture and manipulation of the Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α), a model cytokine. Inside the device, the capture of TNF-α is performed with magnetic beads functionalized with antibodies inside a microfluidic circuit. The beads are captured and manipulated with integrated microcoils. The device also includes a microfluidic detection chamber biofunctionalized with anti-TNF-α antibodies allowing the immobilization of the magnetic beads-TNF-α immunocomplexes. These complexes are then quantified by fluorescence microscopy. In the first part of the thesis, a chemical functionalization process of PDMS, as constituting material of the microfluidic chip, has been developed and optimized for the fabrication of the detection chamber. This functionalization process relies on an amino-silanization reaction and has been characterized with different physico-chemical techniques: water contact angle, EDX, AFM, FTIR and fluorescence microscopy. The prepared surfaces have been validated with an immunoassay on TNF-α with a limit of detection of 0.55 µg/mL (31.6 nM) in fluorescence microscopy [1]. Next, the microfluidic integration of this process relied on the assembly of silanized surfaces with microfluidic channels. A microfluidic protocol for in-flow antibody grafting has been developed and has improved the detection quality in terms of reproducibility, speed and sensitivity with a limit of detection of 0.22 µg/mL (12.64 nM) in fluorescence microscopy. In the second part of the thesis, the use of magnetic beads as carriers for the capture of cytokines has required to choose a bead type that would support the immunocapture of TNF-α. Therefore, an analytical method has been developed with enzymatic digestion of antibodies and size exclusion chromatography (SEC) for characterizing the antibody immobilization quality on the bead’s surface (antibody’s density and orientation). Among several beads types (carboxylic, tosylactivated, streptavidin and protein G), protein G beads have shown the best results with more than 70 000 antibody molecules immobilized on the bead and 75% of them specifically orientated for the capture of TNF-α. In the last section of the thesis, a controlling device for the magnetic capture of protein G beads has been fabricated and characterized inside a clean room. This magnetic device generates a magnetic field strong enough for the capture of beads but with limited thermal effects induced by the electric current injected inside the coils. The coils miniaturization allowed their integration in proximity with the microfluidic circuit, generating a highly localized magnetic field, compatible with the microfluidic chamber’s dimensions. The fabricated magneto-fluidic devices have been evaluated with a first experiment for the functionalization of protein G beads with fluorescent antibodies, bringing a first proof of concept towards their use in the integrated detection of model cytokines (TNF-α).
Les cytokines pro-inflammatoires sont des molécules impliquées dans de nombreuses pathologies (cancer, troubles dépressifs, CoViD-19, …) et présentes dans différents fluides biologiques (sang, sueur, salive, …). Le développement d’un biocapteur capable d’identifier et quantifier les cytokines dans ces différents fluides constituerait une stratégie très innovante dans le suivi des pathologies pro-inflammatoires. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de développer un dispositif microfluidique intégrant des billes magnétiques fonctionnalisées pour la capture et la manipulation d’une cytokine modèle, le Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α). Dans ce dispositif, les billes magnétiques fonctionnalisées avec des anticorps capturent le TNF-α au sein d’un circuit microfluidique et sont manipulées par des microbobines intégrées au dispositif. Une chambre fluidique de détection intégrant une surface biofonctionnalisée avec des anticorps anti-TNF-α permet l’immobilisation des immunocomplexes à base de TNF-α qui seront quantifiés par fluorescence. Dans un premier temps, un protocole de fonctionnalisation chimique du PDMS, matériau support du circuit microfluidique, a été développé et optimisé pour la réalisation de la chambre fluidique de détection. Cette fonctionnalisation par amino-silanisation a été caractérisée par différentes techniques physico-chimiques de surface : angle de contact, EDX, AFM, FTIR et microscopie à fluorescence. Les surfaces préparées ont été validées pour la détection par un immunodosage du TNF-α avec une limite de détection de 0.55 μg/mL (31.6 nM) en microscopie à fluorescence. L’intégration en microfluidique de ce procédé a ensuite consisté en un assemblage des surfaces silanisées avec un circuit microfluidique. Un protocole microfluidique de greffage des anticorps a été développé et a permis d’améliorer la qualité de la détection en termes de reproductibilité, rapidité et sensibilité avec une limite de détection de 0.22 µg/mL (12.64 nM) en fluorescence. Dans la deuxième partie de la thèse, l’utilisation de billes magnétiques comme vecteur de capture des cytokines a nécessité de choisir un modèle de billes en adéquation avec l’immunocapture du TNF-α. Dans cette optique, une méthode analytique a été développée par digestion enzymatique et chromatographie d’exclusion stérique (SEC) permettant de caractériser la qualité de l’immobilisation des anticorps à la surface (densité et orientation des anticorps). Parmi plusieurs modèles de billes (carboxyliques, tosylées, streptavidines et protéines G), les billes protéines G ont montré les meilleures performances avec plus de 70 000 anticorps immobilisés par bille dont 75% d’entre eux spécifiquement orientés pour une capture du TNF-α. Dans la dernière partie de la thèse, un dispositif de contrôle et de capture magnétique des billes protéine G a été élaboré à partir de microbobines de cuivre, encapsulées dans le circuit microfluidique. Celles-ci ont été fabriquées et caractérisées en salle blanche afin de générer un champ magnétique suffisant pour le blocage des billes tout en limitant les effets thermiques dus au courant injecté dans les bobines. La miniaturisation des bobines a permis leur intégration à proximité du circuit microfluidique générant un champ magnétique très localisé compatible avec les dimensions de la chambre de détection. Les dispositifs magnéto-fluidiques réalisés ont été évalués pour des premières expériences de fonctionnalisation des billes magnétiques protéine G par des anticorps fluorescents apportant ainsi la preuve de concept en vue de leur exploitation dans la détection intégrée des cytokines modèles (TNF-α).
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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