Design and in vivo implementation of synthetic RNA switches in E.coli
Conception et implémentation in vivo chez la bactérie E. coli de commutateurs ARN synthétiques
Résumé
This thesis work is a contribution to the general field of synthetic biology of RNA and aims at constructing and testing the functioning of RNA switches controlled by small anti-sense RNAs. The corresponding topic of fundamental research addresses the relationship between sequence, folding and function of an RNA molecule.We have devised RNA switches that adopt two alternative conformations. In one conformation, the RNA forms a transcriptional terminator, stopping the expression of a downstream gene. The alternative conformation undoes the terminator structure and allows read-through to the downstream DNA. The choice of which conformation the RNA molecule adopts depends on the presence or absence of a small regulatory anti-sense RNA. We have validated the functioning of our repressible and inducible switches in vitro. In order to validate the functioning of the switches in vivo, we have constructed and optimized a genetic testing system in the bacterium Escherichia coli. The performance of the switch is measured by the expression of a fluorescent reporter gene cloned downstream of the switch. We have thus been able to provide a proof of concept of the design, construction and in vivo functioning of activatable and repressible RNA switches.Our in vitro and in vivo experiments have allowed us to discover new principles of the design of synthetic RNA switches. We have also been able to optimize the expression conditions of the switches and the measurements methods of the in vivo experiments. The dynamic range of our RNA switches needs to be improved and we have discovered several promising avenues to accomplish this goal. More generally, our results form the basis of a more systematic exploration of the relationships between sequence, folding and functioning of RNA molecules.
Ce travail de thèse s’inscrit dans le thème général de la biologie de synthèse de l’ARN et vise à construire et tester le fonctionnement de commutateurs ARN contrôlés par des petits ARN antisens. La question fondamentale correspondante concerne les relations entre séquence, repliement et fonction d’une molécule d’ARN. Nous avons conçus des ARN commutateurs qui adoptent deux conformations alternatives : une conformation forme un terminateur de la transcription, empêchant l’expression d’un gène en aval, tandis que la conformation alternative ne conduit pas à la terminaison de la transcription. La sélection de la conformation dépend de la présence ou absence d’un petit ARN antisens fournit ou exprimé en trans. Nous avons validé le fonctionnement de commutateurs répressibles et inductibles in vitro. Afin d’évaluer leur fonctionnement in vivo, nous avons construit et optimisé une plateforme génétique chez la bactérie Escherichia coli. Le fonctionnement du commutateur est mesuré par l’expression d’une protéine fluorescente en aval du commutateur. Nous avons ainsi fourni la preuve de concept du fonctionnement de commutateurs activables et répressibles in vivo. Nos expériences in vitro et in vivo nous ont permis de découvrir de nouveaux principes du designs des ARN synthétiques, d’optimiser les conditions d’expression des commutateurs et les méthodes de mesure de l’expression in vivo. La gamme dynamique de la régulation par les petits ARN antisens in vivo doit être augmentée et nous avons identifié les pistes à explorer. Plus généralement, nos résultats ouvrent la voie à l’exploration plus systématique du lien séquence-repliement-fonction des ARN.
Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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