Deuterium labelling of membrane and soluble proteins for neutron crystallography - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2021

Deuterium labelling of membrane and soluble proteins for neutron crystallography

Marquage au deutérium des protéines membranaires et solubles pour la cristallographie neutronique

Résumé

X-ray crystallography is the predominant method for investigating the three-dimensional structures of biomacromolecules. X-rays interact with electrons in the crystalline sample with limited visibility of hydrogen atoms at sub-atomic resolution with only one electron. In neutron macromolecular crystallography (NMX) neutrons interact with atomic nuclei, thus opening up the possibility to locate hydrogen atoms even at a medium resolution. These hydrogen position allow to understand the protonation states of amino acid chains involved in enzymatic mechanisms or even help in investigating the orientation of critical water molecules. Practical reasons such as requirement of large crystals (~1 mm3) is the major limitation, which also implies a requirement for large amounts of protein material. This becomes a major issue while working with membrane proteins as they are known for low protein yields in general. Thus, no membrane protein neutron structure has so far been deposited in PDB. Hydrogen atoms also give a significant background due to their large incoherent cross-section. These problems of large crystal volume and high background can be alleviated by isotope labelling the sample with deuterium (D).The most common strategy for isotope labelling is to produce the recombinant protein in microbial hosts such as Escherichia coli fed on deuterated media allowing the protein to be fully deuterated (‘perdeuterated’). However, D2O can be toxic due to its slightly different physicochemical properties and restricts the growth of bacteria. In this work, a methodology is optimized for production of perdeuterated membrane protein using different carbon sources such as deuterated algae, labelled and unlabeled glycerol. Outer membrane protein F (OmpF) was chosen as the model system to conduct this study as it is known for its high stability and well-characterized with a high-resolution X-ray structure deposited in PDB. It forms a water-filled channel across the outer membrane of E. coli serving as a passage of nutrients and as a barrier for toxic agents. An optimum yield sufficient for growing neutron-sized crystals was achieved by this protocol. Deuteration level and thermal stability of the sample was characterized by mass spectrometry and differential scanning fluorimetry. Perdeuterated crystals diffracted X-rays to a resolution of 1.9 Å and deuteration had no significant effect on structural properties of protein. This work lays the foundation for membrane protein neutron diffraction studies in future.In parallel, we also tested this methodology for a cytoplasmic protein, Triose phosphotase isomerase (TIM) and later used the perdeuterated protein to understand the reaction mechanism by neutron crystallography. TIM is a glycolytic enzyme that catalyzes the inter-conversion of dihydroxyacetone phosphate into glyceraldehyde-3-phosphate in glycolysis cycle. In this reaction Glu167 is proposed as the catalytic base in the rate limiting step and deprotonates the substrate to generate an enediolate intermediate. These intermediates are further stabilized by other catalytic residues including Glu97, the role of which in enzymatic mechanism is not yet well characterized. Here, neutron structure of TIM E97Q and X-ray structure of TIM E167Q variant have been determined using an inhibitor 2-phosphoglycolate as a mimic of enediolate intermediate. Glu97 was shown to have a significant role in reaction mechanism to allow easy relaying of protons. The E617Q structure highlighted the importance of the hydrogen bond geometry along with electrostatic behavior for the formation of the enediolate intermediate. Perdeuteration is therefore critical in obtaining good neutron diffraction data that can reveal the structural details that are indispensable for a mechanistic understanding of protein function.
La cristallographie aux rayons X est la méthode prédominante pour étudier les structures tridimensionnelles des biomacromolécules. Les rayons X interagissent avec les électrons dans l'échantillon cristallin avec une visibilité limitée des atomes d'hydrogène à une résolution subatomique avec un seul électron. Dans la cristallographie macromoléculaire neutronique (NMX), les neutrons interagissent avec les noyaux atomiques, ouvrant ainsi la possibilité de localiser les atomes d'hydrogène. La taille des cristaux est la principale limite, ce qui implique la nécessité de disposer de grandes quantités de protéines. Cela devient un problème majeur lorsqu'on travaille avec des protéines membranaires, car elles sont connues pour leur faible rendement protéique en général. Ainsi, aucune structure neutronique de protéine membranaire n'a été déposée jusqu'à présent dans la base de données PDB. Ces problèmes de grand volume cristallin et de bruit de fond élevé peuvent être atténués par le marquage isotopique de l'échantillon avec du deutérium (D).La stratégie la plus courante pour le marquage isotopique consiste à produire la protéine recombinante dans des hôtes microbiens tels que Escherichia coli, nourris avec des milieux deutérés permettant à la protéine d'être entièrement deutérée ("perdeutérée"). Dans ce travail, une méthodologie est optimisée pour la production des protéines membranaires perdeutérées en utilisant différentes sources de carbone telles que des algues deutérées, du glycérol marqué et non marqué. La protéine de la membrane externe F (OmpF) a été choisie comme système modèle pour mener cette étude car elle est connue pour sa grande stabilité et bien caractérisée par une structure aux rayons X à haute résolution déposée dans la PDB. Elle forme un canal rempli d'eau à travers la membrane externe d'E.coli servant de passage aux nutriments et de barrière aux agents toxiques. Ce protocole a permis d'obtenir un rendement optimal suffisant pour la croissance des cristaux de taille neutronique. Le niveau de deutération et la stabilité thermique de l'échantillon ont été caractérisés par spectrométrie de masse et fluorimétrie à balayage différentiel. Les cristaux perdeutérés ont diffracté les rayons X avec une résolution de 1,9 Å et la deutération n'a eu aucun effet significatif sur les propriétés structurales de la protéine. Ce travail pose les bases d'études futures de la diffraction neutronique des protéines membranaires.En parallèle, nous avons également testé cette méthodologie pour une protéine cytoplasmique, la Triose phosphotase isomérase (TIM) et avons ensuite utilisé la protéine perdeutérée pour comprendre le mécanisme de réaction par cristallographie neutronique. La TIM est une enzyme glycolytique qui catalyse l'interconversion du dihydroxyacétone phosphate en glycéraldéhyde-3-phosphate dans le cycle de la glycolyse. Dans cette réaction, Glu167 est proposé comme base catalytique dans l'étape limitant la vitesse et déprotonise le substrat pour générer un intermédiaire enediolate. Ces intermédiaires sont ensuite stabilisés par d'autres résidus catalytiques dont Glu97, dont le rôle dans le mécanisme enzymatique n'est pas encore bien caractérisé. Ici, la structure neutronique de TIM E97Q et la structure aux rayons X de la variante TIM E167Q ont été déterminées en utilisant un inhibiteur, le 2-phosphoglycolate, comme mimétique de l'intermédiaire enediolate. Il a été démontré que le Glu97 a un rôle important dans le mécanisme de réaction pour permettre un relais facile des protons. La structure E617Q a mis en évidence l'importance de la géométrie de la liaison hydrogène ainsi que le comportement électrostatique pour la formation de l'intermédiaire enediolate. La perdeutération est donc essentielle pour obtenir des bonnes données de diffraction neutronique qui peuvent révéler les détails structuraux indispensables à la compréhension mécanistique de la fonction des protéines.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03477896 , version 1 (13-12-2021)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03477896 , version 1

Citer

Swati Aggarwal. Deuterium labelling of membrane and soluble proteins for neutron crystallography. Biological Physics [physics.bio-ph]. Université Grenoble Alpes [2020-..], 2021. English. ⟨NNT : 2021GRALY021⟩. ⟨tel-03477896⟩
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