Coordination Between DNA Replication and Cell Division To Preserve Genetic Integrity in Normal Growth Conditions and Upon Replication Stress : Key Roles of Chk1 Signaling
Couplage temporel entre la réplication et l’entrée en mitose en conditions normales ou perturbées : rôles de la signalisation Chk1
Résumé
Replication stress is a major source of genomic instability and oncogene-induced replication stress has been proposed to play a key role in cancer development. Accordingly, the checkpoint mechanisms that prevent cell cycle progression under conditions of replication stress are reported to be highly active in pre-neoplastic lesions, where they might act as a potent barrier to tumorigenesis. Yet, multiple works suggest that DNA damage checkpoints are not infallible and that following various genotoxic stresses, DNA alterations may persist up to mitosis despite functional checkpoints mechanisms. Most notably, it was shown that unreplicated DNA may persist at Common Fragile Sites up to late G2 or early mitosis, resulting in chromosomes breaks that affect the genetic stability of the cell lineage. The main question of my PhD was to determine how the DNA checkpoint behave in cells that enter mitosis despite replication stress, and thus help characterize the mechanisms through which checkpoint-proficient cells enter mitosis with persistent DNA alterations. To explore those questions, I developed a highly sensitive and specific FRET biosensor of Chk1 activity and stably expressed this tool in a non-transformed human cells background. This novel system allowed me to describe the precise kinetics of Chk1 activity with exceptional time resolution and exquisite sensitivity in single cell live imaging assays, both following genotoxic stress or under non-perturbed conditions. In a cell background where endogenous PCNA was tagged with a fluorescent protein, I characterized a mild but highly reproducible Chk1 activation pattern in non-perturbed S phase, which correlates tightly with bulk PCNA foci appearance at the G1/S transition and disappearance at the S/G2 transition. This basal activity depends on the constant firing of new replication origins. Following induction of replication stress in S phase, this basal activity is increased but a fraction of S phase cells manages to reach G2 phase, and some further reach mitosis. Even under conditions of replication stress, the decreasing count of PCNA foci in late S phase correlates tightly with progressive Chk1 inactivation. Additionally, the specific expression profile of G2-specific mitotic inducers following PCNA disappearance indicates this is an actual G2 phase. This G2 phase reproducibly lasts several hours before either bifurcating to mitosis or to a p53-dependent G2 arrest.Surprisingly, the kinetics of Chk1 activity in G2 display high heterogeneity and Chk1 can either remain at a minimal level or re-activate in G2 phase to prevent premature mitotic entry. Yet, following Chk1 re-activation in G2 phase, a fraction of cells enter mitosis with a persistent high level of Chk1 activity, providing the first ever observation of mammalian cells entering mitosis despite an active checkpoint. Finally, cells that re-activated Chk1 in G2 phase are less likely to re-enter S phase during the next cell cycle, compared to daughters of cells that did not re-activate Chk1 in G2 phase, suggesting that the structures that activated Chk1 in G2 phase are genotoxic and/or prompt a G1 arrest. All in all, my results provide new insights on the regulation of cell cycle progression under both perturbed and non-perturbed conditions, open previously unforeseen questions about the temporal aspects of ATR/Chk1 activation, and suggest that genotoxic DNA structures arising from replication stress are indeed detected by the DNA damage checkpoint in G2 phase, but can be bypassed by the mitotic entrance machinery.
Le stress réplicatif est une source majeure d'instabilité génétique et pourrait jouer un rôle clé dans le développement tumoral précoce. Des mécanismes de surveillance (checkpoint) qui empêchent la progression du cycle cellulaire sont fortement actifs dans les lésions prénéoplasiques, où ils pourraient agir comme une barrière à la tumorigenèse. Pourtant, de nombreux travaux suggèrent que les checkpoints ne sont pas infaillibles et que suite à divers stress génotoxiques, des altérations de l'ADN peuvent persister jusqu'à la mitose malgré un checkpoint fonctionnel. De l'ADN non répliqué peut notamment persister au niveau des sites fragiles communs (CFS) jusqu'à la fin de la phase G2 ou au début de la mitose, entraînant des gaps et cassures chromosomiques pouvant affecter la stabilité génétique de la lignée cellulaire. Le but de mon doctorat était de déterminer comment le checkpoint se comporte dans les cellules qui entrent en mitose malgré un stress réplicatif et de caractériser les mécanismes par lesquels les cellules entrent en mitose malgré la persistance de structures génotoxiques. Pour explorer ces questions, j'ai développé un senseur FRET spécifique de l'activité Chk1 et ai exprimé cet outil de manière stable dans des cellules humaines non transformées. Ce nouveau système m'a permis de décrire la cinétique précise de l'activité Chk1 avec une forte résolution temporelle en vidéomicroscopie sur cellule unique, que ce soit à la suite d'un stress génotoxique ou dans des conditions non perturbées. Ainsi, dans des cellules où PCNA endogène a été marqué avec une protéine fluorescente, j'ai déterminé que Chk1 s’active faiblement en phase S mais que son profil d’activité dépend de l’activation constante de nouvelles origines de réplication et est fortement corrélé à la dynamique des foyers de réplication. Suite à l'induction d'un stress réplicatif en phase S, cette activité basale est augmentée, mais une fraction des cellules en phase S parvient à atteindre la phase G2. Au cours de cette transition S/G2, Chk1 s’inactive de façon conjointe à la disparition des foyers de réplication, ce qui est suivi par l’expression des inducteurs mitotiques. De manière reproductible, cette phase G2 dure plusieurs heures avant de bifurquer vers la mitose ou vers un arrêt en G2 dépendant de p53. De façon surprenante, la cinétique d'activité Chk1 à la phase G2 montre une forte hétérogénéité et peut soit rester à un niveau minimal, soit se réactiver en phase G2 pour empêcher une entrée en mitose prématurée. J’ai cependant pu déterminer qu’une fraction des cellules entre en mitose malgré la persistance d’un niveau élevé d'activité Chk1, démontrant de façon directe que les cellules de mammifères peuvent entrer en mitose malgré un checkpoint actif. Enfin, au cycle suivant, les cellules dont la mère a réactivé Chk1 à la phase G2 précédente sont moins susceptibles de ré-entrer en phase S au cours du cycle cellulaire suivant, ce qui suggère que les structures qui ont activé Chk1 en phase G2 sont génotoxiques et/ou provoquent un arrêt en G1. Mes résultats élargissent nos connaissances sur la régulation de la progression du cycle cellulaire en conditions normales ou perturbées, ouvrent des questions sur les aspects temporels de l'activation d'ATR/Chk1, et suggèrent que les structures génotoxiques de l'ADN résultant d’un stress réplicatif en phase S sont effectivement détectées par le checkpoint en phase G2, mais que cette activation du checkpoint peut être contournée par les mécanismes d'entrée en mitose.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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