From biogenesis to synaptic organization : developing tools to study AMPAR-associated proteins
De la biogénèse à l'organisation synaptique : mise au point d'outils pour étudier les protéines auxiliaires des AMPAR
Résumé
In the central nervous system, fast excitatory synaptic transmission is mainly mediated by α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors (AMPAR). AMPAR are homo-tetrameric or hetero-tetrameric receptors assembled from different combinations of four core subunits, GluA1-4. These pore-forming subunits then form a macromolecular complex with several structurally unrelated proteins, the AMPAR-auxilliary proteins. To date, more than 30 different auxiliary proteins have been identified. Those are known to exert a wide range of functions on the receptor: from receptor stabilization, endoplasmic reticulum (ER)-export, trafficking, synaptic anchoring, to channel gating modulation. Despite their relevance to proper receptor function and consequently to synaptic transmission, there is still a vast lack of knowledge on their function. So far, the major limiting factor that has hampered these types of studies has been the lack of tools, either to directly visualize the target protein without compromising their function or to directly study the dynamics of their interaction with the receptor in living cells.The ferric-chelate reductase 1-like protein (FRRS1l) was identified as a key player during the early steps of AMPAR biogenesis, but the mechanisms behind its putative role were unknown. More recently, FRRS1l among other ER-interacting proteins has been shown to mediate different stages of AMPAR assembly. However, the dynamics of this process are unknown.On the other hand, the transmembrane AMPAR regulatory proteins (TARP) family was discovered in the early 2000s and was identified as the key mediator of AMPAR trafficking and channel gating. Despite the extensive work done, there is still a lack of tools to allow the study and visualization of surface TARPs without compromising and destabilizing their interaction with AMPARs. Moreover, one of the biggest debates around auxiliary subunits (in particular TARPs), is whether auxiliary subunits dissociate or not from AMPAR complexes at the plasma membrane. This is of particular importance as dissociation of auxiliary subunits could potentially lead to the rearrangement of the AMPAR macromolecular complexes, and thus shape AMPAR-mediated transmission.The overall goal of my PhD has been to develop new tools to study the dynamics of AMPAR and AMPAR-interacting proteins, in particular, the ER-interacting protein FRRS1l and the auxiliary subunits TARP γ2 and γ8. First, I will discuss the strategies I took to unveil the role of FRRS1l during the early steps of the AMPAR biogenesis. In particular, I report the development of new tools to study the interaction between AMPARs and FRRS1l using fluorescence-lifetime imaging microscopy (FLIM)-based Förster resonance energy transfer (FRET). The results here presented show that not only AMPAR and FRRS1l directly interact in living cells, as well as, the ER-resident protein carnitine palmitoyltransferase 1c (CPT1c) cooperates and enhances FRRS1l and AMPAR assembly, as previously suggested. Second, I developed a new tool to label surface TARPs in living neurons using the combination of genetic code expansion with click-labeling. Using this tool, we were able to demonstrate the differential surface organization of γ2 and γ8 both in dissociated hippocampal neurons and hippocampal slice cultures. Moreover, using super-resolution microscopy, we demonstrate that γ2, but not γ8, is organize in nanocluster within the synapses, as previously reported for AMPARs.
Dans le système nerveux central, la transmission synaptique excitatrice rapide est principalement médiée par les récepteurs de l'acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPAR). Les AMPAR sont des récepteurs homo ou hétéro tétramériques assemblés à partir de combinaisons de quatre sous-unités, GluA1-4 qui forment un pore. Celui-ci s’assemble en un complexe macromoléculaire avec plusieurs protéines structurellement non apparentées, les protéines auxiliaires des AMPAR. Plus de 30 protéines auxiliaires différentes ont été identifiées. Celles-ci exercent un large éventail de fonctions sur le récepteur : stabilisation, exportation du réticulum endoplasmique (ER), trafic, ancrage synaptique, modulation du canal. Malgré leur importance pour le bon fonctionnement des récepteurs et, par conséquent, pour la transmission synaptique, leurs fonctions restent mal connues. Le principal facteur limitant a été le manque d'outils, soit pour visualiser directement la protéine cible sans compromettre sa fonction, soit pour étudier directement la dynamique de son interaction avec le récepteur dans des cellules vivantes.La protéine ferric-chelate reductase 1-like (FRRS1l) a été désignée comme un acteur clé au cours des premières étapes de la biogenèse des AMPAR, mais les mécanismes à l'origine de ce rôle putatif étaient inconnus. Récemment, il a été montré que FRRS1l, parmi d'autres protéines interagissant avec l’ER, participe aux différentes étapes de l'assemblage des AMPAR. Cependant, la dynamique de ce processus est inconnue.D'autre part, la famille des protéines régulatrices transmembranaires d'AMPAR (TARP) a été découverte au début des années 2000 et a été identifiée comme le médiateur clé du trafic des AMPAR et de la régulation de leurs propriétés biophysiques. Malgré les nombreux travaux réalisés, il manque encore des outils permettant d'étudier et de visualiser les TARP de surface sans compromettre et déstabiliser leur interaction avec les AMPAR. De plus, l'un des plus grands débats autour des sous-unités auxiliaires (en particulier les TARP), est de savoir si les sous-unités auxiliaires se dissocient ou non des complexes AMPAR à la membrane plasmique. Cette question est particulièrement importante car la dissociation des sous-unités auxiliaires pourrait potentiellement conduire à la réorganisation des complexes macromoléculaires des AMPAR, et ainsi façonner la transmission médiée par les AMPAR.L'objectif général de ma thèse était de développer de nouveaux outils pour étudier la dynamique des AMPAR et des protéines interagissant avec les AMPAR, en particulier la protéine FRRS1l et les TARP γ2 et γ8. Tout d'abord, je discuterai des stratégies que j'ai adoptées pour dévoiler le rôle de FRRS1l au cours des premières étapes de la biogenèse des AMPAR. En particulier, je rapporte le développement de nouveaux outils pour étudier l'interaction entre les AMPAR et FRRS1l en utilisant le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) basé sur la microscopie d'imagerie par fluorescence (FLIM). Mes résultats montrent que non seulement les AMPAR et FRRS1l interagissent directement dans les cellules vivantes, mais aussi que la carnitine palmitoyltransferase 1c (CPT1c), protéine résidant dans l’ER, coopère et améliore l'assemblage de FRRS1l et des AMPAR, comme cela a été suggéré précédemment. Deuxièmement, j’ai développé un nouvel outil pour marquer les TARP de surface dans les neurones vivants en utilisant la combinaison de l'expansion du code génétique avec le marquage par clic. Grâce à cet outil, nous avons pu démontrer l'organisation différentielle de surface de γ2 et γ8 à la fois dans des neurones hippocampiques dissociés et dans des cultures de tranches d'hippocampe. De plus, en utilisant la microscopie à super-résolution, nous avons démontré que γ2, mais pas γ8, est organisé en nanodomaines dans les synapses, comme précédemment rapporté pour les AMPARs.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
|---|