Description and functional analysis of the t-SNARE SNAP33 in Arabidopsis thaliana - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2021

Description and functional analysis of the t-SNARE SNAP33 in Arabidopsis thaliana

Description et caractérisation fonctionnelle du t-SNARE SNAP33 chez Arabidopsis thaliana

Résumé

SNAREs (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors) mediate vesicle fusion during several processes in plants and contribute to homeostasis, immunity, growth, and development. Among this gene family, SNAP33 codes for a t-SNARE (target-SNARE) protein involved in vesicle fusion to the plasma membrane during cytokinesis and immunity. One of the most intriguing traits of the snap33 knock-out mutant is the early development of spontaneous lesions and a severely dwarf morphology under normal growth conditions. My Ph.D.’s objectives were first to better characterize the phenotype of snap33 at both macroscopic and molecular levels and to determine the pathways responsible for this phenotype. Then, my second Ph.D. objective was to assess a potential connection, suggested by literature data, between SNAP33 and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) also known to be involved in plant immunity. Phenotypic characterization of three allelic snap33 mutants revealed that snap33 exhibits features of a lesion-mimic phenotype, including spontaneous cell death, constitutive expression of biotic stress marker genes, over-accumulation of the three main defense phytohormones salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA), and ethylene (ET), and over-accumulation of reactive oxygen species (ROS). RNA-seq analyses of 5- and 12-day-old snap33 seedlings, respectively before and after the onset of lesions, showed that numerous genes involved in defense-responses are up-regulated as early as in the 5-day-old snap33 mutant. Additionally, we found an up-regulation of numerous Resistance (R) genes in snap33 at 12 days compared to WT. Genetic analyses showed that snap33’s phenotype mainly depends on the SA pathway, and indicated the involvement of R protein signaling. These results strongly suggest that SNAP33, or its function, is guarded by one or several R proteins. The MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4 MAPK module is rapidly activated in response to pathogen infection and contributes to the establishment of immune responses by phosphorylating various substrates. The mpk4 and mekk1 single mutants, as well as the mkk1 mkk2 double mutant, display a lesion-mimic phenotype similar to that of the snap33 mutant. Besides, SNAP33 is known to be phosphorylated in vivo on sites whose kinase motifs are compatible with the MAPK kinase signature. These data prompted us to examine the possibility of a relationship between SNAP33 and MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4. We hypothesized that the MAPK module might be involved in regulating SNAP33 activity during immunity or that SNAP33 might regulate the MAPK module. Using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays, we found that SNAP33 interacts in vivo with MEKK1, MKK2 and MPK4. However, these results could not be confirmed by complementary approaches, suggesting that, if physiologically true, these interactions are likely to be transient. We also explored whether SNAP33 is an in vitro substrate of MPK4 and of two other MAPKs involved in immunity, namely MPK3 and MPK6. MPK3, MPK4 and MPK6 did not phosphorylate SNAP33, strongly suggesting that SNAP33 is not a substrate of any of these MAPKs. We finally examined a possible genetic connection between SNAP33 and the MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4 MAPK module. However, none of known suppressors of mekk1, mkk1 mkk2 and mpk4 phenotype reverted snap33 phenotype. Overall, our data suggest that SNAP33 and the MAPK module function independently, albeit both are involved in immune responses.
Les SNAREs (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors) sont impliqués dans le trafic vésiculaire au cours de plusieurs processus chez les plantes et contribuent à l'homéostasie, l'immunité, la croissance et le développement.Parmi cette famille de gènes, SNAP33 code pour une protéine t-SNARE (target-SNARE) impliquée dans la fusion des vésicules à la membrane plasmique au cours de la cytokinèse et de l'immunité. L'un des traits les plus intrigants du mutant perte de fonction snap33 est le développement précoce de lésions spontanées et une morphologie naine dans des conditions de croissance normales. Les objectifs de mes travaux de thèse étaient d'abord de mieux caractériser le phénotype de snap33 aux niveaux macroscopique et moléculaire et de déterminer les voies biologique responsables de ce phénotype. Ensuite, le deuxième objectif était d'évaluer un lien potentiel entre SNAP33 et des protéines MAPKs (Mitogen-activated protein kinase) également connues pour être impliquées dans l'immunité des plantes.La caractérisation phénotypique de trois mutants alléliques snap33 a révélé que le mutant snap33 présente plusieurs caractéristiques de mutants auto-immuns, notamment de la mort cellulaire spontanée, l'expression constitutive de gènes marqueurs de stress biotique, la suraccumulation des trois principales phytohormones de défense, l'acide salicylique (SA), l'acide jasmonique (JA), et l'éthylène (ET), et la suraccumulation d'espèces réactives de d'oxygène (ROS). Des analyses transcriptomique de type séquençage d’ARN (RNA-seq) sur des plantes snap33 âgés de 5 et 12 jours, avant et après l'apparition des lésions, respectivement ont montré que de nombreux gènes impliqués dans les réponses immunitaires sont suréxprimés le mutant snap33 dès le stade 5 jours. De plus, le mutant snap33 montre une surepression de nombreux gènes de résistance (R) à 12 jours par rapport aux plantes sauvages (WT). Nos analyses génétiques ont montré que le phénotype de snap33 dépend principalement de la voie SA et ont indiqué l'implication de la signalisation par les protéine R. Ces résultats suggèrent fortement que SNAP33, ou sa fonction, est gardée par une ou plusieurs protéines R.Le module MAPK MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4 est rapidement activé en réponse à une infection pathogène et contribue à l'établissement de réponses immunitaires en phosphorylant divers substrats. Les mutants simples mpk4 et mekk1, ainsi que le double mutant mkk1 mkk2, présentent un phénotype similaire à celui du mutant snap33. Par ailleurs, SNAP33 est connu pour être phosphorylé in vivo sur des sites dont les motifs kinases sont compatibles avec la signature MAPK kinase. Ces données nous ont incités à examiner la possibilité d'une relation entre SNAP33 et MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4. Nous avons émis l'hypothèse que le module MAPK pourrait être impliqué dans la régulation de l'activité SNAP33 pendant l'immunité ou que SNAP33 pourrait réguler le module MAPK. En utilisant des tests de complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC), nous avons constaté que SNAP33 interagit in vivo avec MEKK1, MKK2 et MPK4. Cependant, ces résultats n'ont pas pu être confirmés par des approches complémentaires, suggérant que, si elles sont physiologiquement vraies, ces interactions sont susceptibles d'être transitoires. Nous avons également exploré si SNAP33 est phosphorylé in vitro par MPK4 et deux autres MAPK impliquées dans l'immunité, à savoir MPK3 et MPK6. MPK3, MPK4 et MPK6 n'ont pas phosphorylé SNAP33, ce qui suggère fortement que SNAP33 n'est un substrat d'aucune de ces MAPK. Nous avons finalement examiné une éventuelle connexion génétique entre SNAP33 et le module MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4 MAPK. Cependant, aucun des suppresseurs connus des phénotypes de mekk1, mkk1 mkk2 et mpk4 n'a supprimé le phénotype snap33. Dans l'ensemble, nos données suggèrent que SNAP33 et le module de MAPK fonctionnent indépendamment, bien que tous deux soient impliqués dans les réponses immunitaires.
Fichier principal
Vignette du fichier
2021UPASL098.pdf (12.18 Mo) Télécharger le fichier
Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03620519 , version 1 (26-03-2022)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03620519 , version 1

Citer

Houda Henchiri. Description and functional analysis of the t-SNARE SNAP33 in Arabidopsis thaliana. Vegetal Biology. Université Paris-Saclay, 2021. English. ⟨NNT : 2021UPASL098⟩. ⟨tel-03620519⟩
192 Consultations
130 Téléchargements

Partager

Gmail Mastodon Facebook X LinkedIn More