Electrospinning of chitosan based polymeric systems for the production of nanostructured scaffolds. Characterization and potential application in tissue engineering
Electrofilage de systèmes polymères à base de chitosane pour la production de substrats nanostructurés. Caractérisation et application potentielle en ingénierie tissulaire
Résumé
Tissue engineering represents a potential approach to improve cartilage mending, where an artificial 3D extracellular matrix (ECM) is essential to generate new tissues. Native ECMs can be effectively mimicked by electrospun nanofiber membranes, specially using natural sourced polymers.In this work, chitosan (CS)-based systems (CS and CS/Hyaluronan (HA)) are transformed, by electrospinning, into biocompatible and biodegradable nanofibrous mats adapted for chondrocyte (CHCT) development. CS materials are claimed to favor cell adhesion and growth, providing the microenvironment adequate for CHCT phenotype preservation. No current procedures for cartilage renovation have successfully achieved long-lasting cartilage regeneration.Homogeneous CS, HA, and CS/HA polyelectrolyte complex solutions are prepared using formic acid mixtures as solvent. Stability of the complex is improved by thermal treatment at 120°C. After treatment, material crystallization and amide bond formation are related to modifications of physicochemical properties.Enabling electrospinning, polyethylene oxide (PEO) is incorporated to the CS and HA solutions. The PEO content in the blend is set at 30 % and electrospun CS/PEO and CS/HA/PEO fibers are obtained, with diameters ranging between 100-200 nm. Several collector types allow the production of nanofibrous mats with a visible fiber arrangement depending on the collector structure. Patterned fiber mats are produced and applied for CHCT culture and cell morphology observation.Atomic force microscopy measurements between single CHCT and CS film and fibers, help to compare adhesion strength as a function of substrate topography. The cell-substrate adhesive force is found slightly higher in the case of CS film compared to the mat. Nevertheless, adhesion is more efficient on the mats, considering a lower effective contact area (support porosity ~40%).For cell culture, the importance of CS fiber stabilization is highlighted. Cell proliferation tests, performed on CS fiber mats, revealed that fiber mats lead to higher proliferation rates compared to casted films.Topography of electrospun CS nanofiber membranes could impact cell colonization patterns. Cell alignment in certain zones of aligned fiber samples is detected. In the same way, concentration of cells is observed on zones of the mat more fiber densely charged.When comparing CHCT development on CS and CS/HA substrates, it is found that cell confluency is achieved earlier on CS/HA than on CS fibers. Cell development could be improved by the presence of HA in the support, as a natural component of the ECM, favoring cell adhesion. In both cases, high CHCT viability (>90%) is detected.Regarding cell morphology, primary CHCT maintain an oval shape in cartilage. This form is also observed for CHCT on CS and CS/HA fibrous mats. On the contrary, cells spread during monolayer cultures on flat surfaces such as films and Petri dish. Morphology preservation could indicate native cell characteristics maintaining.As an alternative for cell/substrate implantation, the feasibility of intra-articular injections of cell/fiber suspensions is studied. Proliferation profiles differ significatively from CS fiber mats, mainly attributed to the limited available surface for cell development on the fiber suspension in contrast with the continuous mat. However, since some patients do not fit for surgery, the injectable approach could become a viable treatment for cartilage regeneration.In conclusion, electrospinning process optimization and material characterization allowed the use of stable nanofiber mats for CHCT development in pursuit of tissue repair applications. Compatibility of CS-based fiber mats is confirmed and substrate efficiency compared as a function of material topography.Considering the promising results herein obtained, CS and CS/HA nanofibrous mats can be considered as potential scaffolds maintaining adequate proliferation profiles and native cell shape.
L'ingénierie tissulaire représente une approche potentielle pour améliorer la réparation du cartilage, où une matrice extracellulaire (MEC) 3D artificielle est essentielle pour générer de nouveaux tissus. Les ECM natives peuvent être efficacement imitées par des membranes de nanofibres électrofilées, notamment en utilisant des polymères d'origine naturelle.Dans ce travail, des systèmes à base de chitosane (CS) (CS et CS/Hyaluronan (HA)) sont transformés, par électrofilage, en mats nanofibreux biocompatibles et biodégradables adaptés au développement des chondrocytes (CHCT). Les matériaux CS sont censés favoriser l'adhésion et la croissance des cellules, fournissant l’environnement adéquat pour la préservation du phénotype des CHCT.Des solutions homogènes de CS, HA et CS/HA sont préparées en utilisant de l’acide formique/eau comme solvant. La stabilité du complexe CS/HA est améliorée par un traitement thermique à 120°C. Après le traitement, la cristallisation du matériau et la formation de liaisons amides sont reliées aux modifications des propriétés physicochimiques.Pour permettre l'électrofilage, de l'oxyde de polyéthylène (PEO) est incorporé aux solutions de CS et HA. La teneur en PEO dans le mélange est fixée à 30 % pour obtenir des fibres de CS/PEO et CS/HA/PEO, dont les diamètres sont compris entre 100 et 200 nm. Plusieurs types de collecteurs permettent la production de matrices de fibres avec un arrangement visible selon la structure du collecteur. Des matrices de fibres à motifs sont produits et appliqués pour la culture de CHCT et l'observation de la morphologie cellulaire.Pour la culture cellulaire, l'importance de la stabilisation des fibres CS est mise en évidence. Des tests de prolifération cellulaire, réalisés sur des membranes de fibres de CS, ont révélé que les fibres conduisent à des taux de prolifération plus élevés par rapport aux films.La topographie des membranes de nanofibres de CS électrofilées pourrait avoir un impact sur les modèles de colonisation cellulaire. L'alignement des cellules dans certaines zones des fibres alignées est détecté. De même, la concentration des cellules est observée sur des zones du mat plus densément chargées en fibres.En comparant le développement des CHCT sur les substrats CS et CS/HA, on constate que la confluence cellulaire est atteinte plus tôt sur le CS/HA que sur le CS. Le développement cellulaire pourrait être impacté par la présence de HA, en tant que composant naturel de l'ECM, favorisant l'adhésion cellulaire sur les fibres CS/HA. Dans les deux cas, une viabilité élevée des CHCT (>90%) est détectée.Sur morphologie des cellules, les CHCT primaires conservent une forme ovale dans le cartilage. Cette forme est également observée pour les CHCT sur les matrices de CS et CS/HA. Au contraire, les cellules s'étalent lors de cultures en monocouche sur des surfaces planes (films et plaques). La préservation de la morphologie pourrait indiquer le maintien des caractéristiques natives des cellules.Comme alternative à l'implantation de cellules/substrats, la faisabilité d'injections intra-articulaires de suspensions de cellules/fibres est étudiée. Comme certains patients ne sont pas aptes à subir une intervention chirurgicale, l'approche injectable pourrait devenir un traitement viable pour la régénération du cartilage.En conclusion, l'optimisation du processus d'électrofilage et la caractérisation des matériaux ont permis l'utilisation de matelas de nanofibres stables pour le développement de CHCT en vue d'applications de réparation tissulaire. La compatibilité des matelas de fibres à base de CS est confirmée et l'efficacité du substrat est comparée en fonction de la topographie du matériau.Au vu des résultats prometteurs obtenus, les matrices de nanofibres CS et CS/HA peuvent être considérés comme des échafaudages potentiels, conservant des profils de prolifération adéquats et la forme native des cellules.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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