The DnaA cell cycle oscillator and its coordination with cell growth and division in Escherichia coli
L'oscillateur du cycle cellulaire DnaA et sa coordination avec la croissance et la division cellulaires chez Escherichia coli
Résumé
Despite over 50 years of study, key questions on the bacterial cell cycle remain unanswered. In particular, the debate is open concerning the regulation of DNA replication initiation in E. coli and its role in the dynamics of cell growth and division. A key player in these processes is the DnaA protein, which is involved the initiation of DNA replication. DnaA is commonly believed to be a cell cycle oscillator and a cell size sensor, but neither of these facts have been firmly established.DnaA activity depends on its nucleotide bound state, the ATP bound form being the active one for origin recognition and activation. DnaA is also a transcription factor, a highly connected node in the network of genes coding for proteins required for DNA replication and the repair of DNA damage. The differential regulation of gene expression by the different DnaA nucleotide bound forms, including the regulation of its own promoter, is believed to be central in its role of cell-cycle oscillator and regulator. Indeed, because of its double role as a transcription factor and an activator of the initiation of the DNA replication process, the DnaA protein can act as the regulatory link between the timing and level of gene expression and the different phases of the bacterial cell cycle.This thesis addresses the problem of identifying the cell cycle oscillator related to DnaA activity, and relating it to the progression of the E. coli cell cycle, focusing in particular on cell-size sensing, individual cell growth rate, and cell division.One of the major challenges in this area has been to quantify the changes in DnaA-ATP activity in vivo in real time. This problem requires single-cell dynamic resolution, in order to relate DnaA levels and activity to key cell-cycle transitions. To address this problem, I have developed a set of reporters of gene expression using a gene for a fluorescent protein under control of a promoter that is regulated by DnaA-ATP, and deployed them in single-cell experiments coupling quantitative microscopy and microfluidics.To obtain robust and long-term single-cell tracking in steady growth conditions I have designed a dedicated experimental setup and data-analysis pipeline for studying the growth, size, and gene expression of E. coli in controlled environmental conditions.A careful analysis of these single cell data as a function of the cell cycle shows that E. coli growth is biphasic and it follows the expression of a constitutive ori-proximal promoter.Moreover, thanks to the analysis of different reporters, I was able to quantify for the first time the effect of the DnaA-dependent promoter regulatory elements. Specifically, I found that the volume-specific production rate of GFP from the DnaA promoter is a well-defined cell-cycle oscillator and that the signal from this oscillator can be related to key cell-cycle processes such as DNA replication and cell division.However, while the standard view of the cell cycle sees it as the result of a single oscillator, our data lead me to suggest that at least two coupled oscillators are needed to describe the processes that coordinate DNA replication, cell growth and cell-cycle progression. My approach also makes it possible to detect causality links between these different processes.These findings combine the use of mathematical models and single-cell dynamic data to pose firmer quantitative bases for a characterization of the mechanisms determining robust cell cycle progression in bacteria.
Malgré plus de 50 ans d'études, des questions clés sur le cycle cellulaire bactérien restent sans réponse. En particulier, le débat est ouvert concernant la régulation de l'initiation de la réplication de l'ADN chez E. coli et son rôle dans la dynamique de la croissance et de la division cellulaire. Un acteur clé de ces processus est la protéine DnaA, qui est impliquée dans l'initiation de la réplication de l'ADN. On pense généralement que DnaA est un oscillateur du cycle cellulaire et un senseur de taille cellulaire, mais aucun de ces faits n'a été fermement établi.L'activité de DnaA dépend de son état de liaison aux nucléotides, la forme liée à l'ATP étant celle qui est active pour la reconnaissance et l'activation de l'origine. DnaA est également un facteur de transcription, un nœud hautement connecté dans le réseau des gènes codant pour les protéines nécessaires à la réplication de l'ADN. La régulation différentielle de l'expression des gènes par les différentes formes liées aux nucléotides de DnaA, y compris la régulation de son propre promoteur, est considérée comme centrale dans son rôle d'oscillateur et de régulateur du cycle cellulaire. En effet, en raison de son double rôle de facteur de transcription et d'activateur de l'initiation du processus de réplication de l'ADN, la protéine DnaA peut agir comme le lien régulateur entre le timing et le niveau d'expression des gènes et les différentes phases du cycle cellulaire bactérien.Cette thèse aborde le problème de l'identification de l'oscillateur du cycle cellulaire lié à l'activité de DnaA, et de sa mise en relation avec la progression du cycle cellulaire de E. coli, en se concentrant en particulier sur la détection de la taille des cellules, le taux de croissance des cellules individuelles et la division cellulaire.L'un des principaux défis dans ce domaine a été de quantifier les changements dans l'activité DnaA-ATP in vivo en temps réel. Ce problème nécessite une résolution dynamique de cellule unique, afin de relier les niveaux et l'activité DnaA aux transitions clés du cycle cellulaire. Pour résoudre ce problème, j'ai développé un ensemble de rapporteurs d'expression génétique utilisant un gène pour une protéine fluorescente sous le contrôle d'un promoteur qui est régulé par DnaA-ATP.De plus, j'ai conçu un dispositif expérimental couplant microscopie quantitative et microfluidique et un pipeline d'analyse de données dédiés à l'étude de la croissance, de la taille et de l'expression génétique des E. coli dans des conditions environnementales contrôlées.Une analyse minutieuse de ces données de la cellule unique en fonction du cycle cellulaire montre que la croissance de E. coli est biphasique et qu'elle suit l'expression d'un promoteur constitutif ori-proximal.De plus, grâce à l'analyse de différents reporters, j'ai pu quantifier pour la première fois l'effet des éléments régulateurs du promoteur dépendant de DnaA. Plus précisément, j'ai découvert que le taux de production de GFP spécifique du volume à partir du promoteur DnaA est un oscillateur du cycle cellulaire bien défini et que le signal de cet oscillateur peut être lié aux processus clés du cycle cellulaire tels que la réplication de l'ADN et la division cellulaire.Cependant, alors que la vision standard du cycle cellulaire le considère comme le résultat d'un seul oscillateur, nos données me conduisent à suggérer qu'au moins deux oscillateurs couplés sont nécessaires pour décrire les processus qui coordonnent la réplication de l'ADN, la croissance cellulaire et la progression du cycle cellulaire. Mon approche permet également de détecter des liens de causalité entre ces différents processus.Ces résultats combinent l'utilisation de modèles mathématiques et de données dynamiques du cellule unique afin de poser des bases quantitatives plus solides pour une caractérisation des mécanismes déterminant une progression robuste du cycle cellulaire chez les bactéries
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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