Identification des substrats ARN de l'hélicase Ded1 et de son rôle biologique chez la levure - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2021

Identification of the RNA substrates of the Ded1 RNA helicase and its biological role in yeast

Identification des substrats ARN de l'hélicase Ded1 et de son rôle biologique chez la levure

Hilal Yeter
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1173398
  • IdRef : 264917243

Résumé

The DEAD-box RNA helicase Ded1 is an essential yeast protein involved in translation initiation. Mammalian DDX3 and related proteins from other organisms complement a yeast strain deleted for the endogenous DED1 gene, which demonstrates a high degree of functional conservation. Moreover, DDX3 is implicated in oncogenesis and viral replication. In vitro, the purified Ded1 protein is an ATP-dependent RNA binding protein and an RNA-dependent ATPase, but it lacks RNA substrate specificity and enzymatic regulation. We have previously found that Ded1 is a cap-associated factor that actively shuttles between the nucleus and cytoplasm and colocalized with cellular foci. We studied the role(s) of Ded1 in the cell by characterizing its RNA substrates. For that, we used a modified PAR-CLIP (Photoactivable Ribonucleoside-enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) technique that uses long UV light (UV-A) because we find that Ded1 is rapidly degraded, both in vitro and in vivo, with short UV light (UV-C) that is typically used. Our results indicate that Ded1 preferentially interacts with a subset of mRNAs that show no correlation with the length of the UTR or coding regions, or with the mRNA abundance. Ded1 interacts mostly with certain mRNAs encoding proteins involved in translation. Moreover, we find by yeast genetics, in situ localization and in vitro biochemical approaches that Ded1 is associated with and regulated by the signal recognition particle (SRP), which is a universally conserved ribonucleoprotein complex required for the cotranslational translocation of polypeptides into the endoplasmic reticulum lumen and membrane. Ded1 is physically associated with SRP components in vivo and in vitro. Ded1 is genetically linked with SRP proteins. Finally, the enzymatic activity of Ded1 is inhibited by SRP21 with SRP RNA, SCR1. We propose a model where Ded1 actively participates in the translocation of proteins during translation and we open a new comprehension of the cellular role of Ded1 during translation.
L’hélicase à ARN à boîte DEAD, Ded1, est une protéine essentielle de levure impliquée dans l'initiation de la traduction. La protéine humaine DDX3 et des protéines appartenant à d'autres organismes complémentent une souche de levure délétée pour le gène DED1 endogène, démontrant un fort degré de conservation fonctionnelle. De plus, DDX3 est impliquée dans l'oncogenèse et la réplication virale. In vitro, la protéine Ded1 purifiée lie l’ARN en présence d’ATP et a une activité ATPase dépendante de l'ARN, mais elle manque de spécificité de substrat et de régulation enzymatique. Nous avons précédemment montré que Ded1 est un facteur associé au cap qui fait la navette entre le noyau et le cytoplasme et colocalise avec des foci cellulaires. Pour mieux comprendre le(s) rôle(s) de Ded1 dans la cellule nous avons identifié les ARN qui lui sont associés. Pour cela, nous avons utilisé la technique de PAR-CLIP modifiée (réticulation et immunoprécipitation améliorées par un ribonucléoside photoactivable) qui utilise des UV longs (UV-A) car nous avons constaté que Ded1 est rapidement dégradée avec des UV courts (UV-C), classiquement utilisé, à la fois in vitro et in vivo. Nos résultats indiquent que Ded1 interagit préférentiellement avec un sous-ensemble d'ARNm et ne montrent aucune corrélation avec la longueur des UTR ou des régions codantes, ni avec l'abondance des transcrits. Ded1 interagit principalement avec certains ARNm codant pour des protéines impliquées dans la traduction. De plus, par des techniques de génétique de la levure, de localisation in situ et par les approches biochimiques in vitro, nous avons trouvé que Ded1 est associée et régulée par la particule de reconnaissance du signal (SRP), qui est un complexe ribonucléoprotéique universellement conservé nécessaire à la translocation co-traductionnelle des polypeptides dans la lumière du réticulum endoplasmique et la membrane. Nos résultats indiquent que Ded1 est physiquement associée aux composants de la SRP in vivo et in vitro et est génétiquement liée aux protéines de la SRP. Enfin, l'activité enzymatique de Ded1 est inhibée par la Srp21 en présence de l'ARN de la SRP, SCR1. Nous proposons un modèle où Ded1 participe activement à la translocation des protéines lors de la traduction et nous établissons une nouvelle compréhension du rôle cellulaire de Ded1 lors de l’étape de l’élongation de la traduction.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03810483 , version 1 (11-10-2022)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03810483 , version 1

Citer

Hilal Yeter. Identification des substrats ARN de l'hélicase Ded1 et de son rôle biologique chez la levure. Biochimie, Biologie Moléculaire. Université Paris sciences et lettres, 2021. Français. ⟨NNT : 2021UPSLT001⟩. ⟨tel-03810483⟩
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