Employing an insect Sf9 cell model system of the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, to investigate the role of transcription factors on the expression of detoxification genes in response to xenobiotics - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2022

Employing an insect Sf9 cell model system of the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, to investigate the role of transcription factors on the expression of detoxification genes in response to xenobiotics

Utilisation du modèle cellulaire de la légionnaire d'automne, Spodoptera frugiperda, les cellules Sf9 pour étudier le rôle de facteurs de transcription sur l'expression des gènes de détoxification en réponse aux xénobiotiques

Dries Amezian
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1185051
  • IdRef : 262217015

Résumé

The fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is a polyphagous pest feeding on numerous host-plants including important crops such as maize, rice and sorghum. It is one of the world’s most destructive pests which only recently invaded the eastern hemisphere incl. Asia. It provides exceptional economic damage in many crops across continents each year. Controlling this insect pest largely relies on the application of insecticides resulting in the development of resistance to many classes of synthetic insecticides. FAW has developed sophisticated adaptive mechanisms to eliminate xenobiotics (plant secondary metabolites and insecticides), among them, upregulation and duplication of genes expressing detoxification enzymes. They are often expressed at low basal level and induced when the insect is exposed to xenobiotics. While the role of these enzymes is well characterized in several pest insects, the transcription factors controlling their expression remain largely unexplored. The aim of my thesis was to determine the role of Cap'n'collar isoform C (CncC) and musculoaponeurotic fibrosarcoma (Maf) in S. frugiperda adaptation to xenobiotics employing an Sf9 cell model.I used the cell model of S. frugiperda, the Sf9 cells and showed that CncC, Maf and several detoxification enzymes are induced after exposure to indole 3-carbinol (I3C), a glucosinolate found in Brassicaceae such as cabbage and broccoli, and methoprene (Mtp), a juvenile hormone (JH) mimic insecticide. I showed that transient overexpression of CncC and Maf in Sf9 cells was followed by overexpression of several detoxification genes. In order to characterize the role of these transcription factors in response to xenobiotics two types of stably transformed cell lines were established. The first cell lines overexpress CncC, Maf or both genes while the second were mutated for CncC (Knock-Out, KO) using the CRISPR/Cas9 technique. I performed cell viability assays (MTT) and used molecular probes in High Content Screening (HCS) to test whether the modification of the CncC:Maf pathway affected the ability of Sf9 cells to cope with toxic stress. The OE cell lines were more tolerant to I3C and Mtp than the control (wildtype Sf9 cell line), whereas the KO cell lines were more sensitive to these xenobiotics. The activities of some detoxification enzymes, carboxylesterases (CEs) and glutathione S-transferases (GSTs) toward model substrates were also increased in OE cell lines, whereas they were decreased in KO cell lines. Recent studies have suggested that activation of the CncC:Maf pathway is mediated by the production of reactive oxygen species (ROS) upon toxic stress. I therefore measured ROS production in Sf9 cells treated with I3C and Mtp. Both xenobiotics triggered in-cell ROS pulses although at limited levels in OE lines, unlike to KO lines for which ROS levels were more prominent. The use of an antioxidant suppressed the ROS pulses and restored tolerance of KO cells to I3C and Mtp. Finally, I compared the differentially expressed genes in the OE and KO cell lines in a transcriptomic analysis using RNA-seq. This allowed me to identify genes potentially controlled by CncC and Maf, most of them being detoxification genes with a role in insecticide resistance and metabolism of plant compounds as demonstrated in several studies. In conclusion, I present here new data in designed model Sf9 cell lines suggesting that the CncC:Maf signaling pathway plays a central role in FAW adaptation to toxic environmental compounds and insecticides. This knowledge helps to better understand pathways in detoxification gene expression and can be helpful to design next- generation insect control measures by interfering with these pathways and detoxification gene expression.
La légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), est un ravageur polyphage qui se nourrit de nombreuses plantes hôtes, dont des cultures importantes comme le maïs, le riz et le sorgho. Ce ravageur est responsable chaque année de milliards de dollars de pertes agricoles et n'a envahi que récemment l'hémisphère oriental, dont l'Asie. La lutte contre cet insecte se base principalement sur l’utilisation d’insecticides ce qui a entrainé l’apparition de résistance à de nombreuses classes chimiques d’insecticides. S. frugiperda a développé des mécanismes sophistiqués d’adaptation pour éliminer les composés toxiques (toxines de plantes ou insecticides) comme la surexpression et la duplication de gènes d’enzymes de détoxication. Souvent exprimées à un niveau basal, ces enzymes sont induites quand l’insecte est exposé à un xénobiotique. Si ces dernières sont bien connues chez plusieurs insectes ravageurs, les facteurs de transcription impliqués dans le contrôle de leur expression restent largement inexplorés. Le but de ma thèse a été de déterminer le rôle du facteur de transcription Cap'n'collar isoforme C (CncC) et musculoaponeurotic fibrosarcoma (Maf) dans l’adaptation de S. frugiperda aux xénobiotiques en utilisant le modèle cellulaire Sf9. J'ai montré que CncC et plusieurs gènes de détoxication sont induits par l'indole 3-carbinol (I3C), un glucosynolate présent dans les Brassicaceae comme le chou et le brocoli, et le méthoprène (Mtp), un insecticide qui imite l'hormone juvénile (JH). J’ai montré que la surexpression transitoire de CncC en cellules Sf9 est suivie d'une surexpression de certains de ces mêmes gènes de détoxication. Afin de caractériser le rôle des facteurs de transcription dans cette réponse j’ai établi deux types de lignées cellulaires transformées de manière stable. Le premier surexprime (OE) CncC, Maf ou les deux gènes et le second a été muté pour CncC (Knock-Out, KO) en utilisant la technique du CRISPR/Cas9. J’ai réalisé des tests de viabilité (MTT) et utilisé des sondes moléculaires en High Content Screening (HCS) pour tester si la modification de la voie de CncC:Maf affectait la capacité des cellules à faire face au stress toxique. Les lignées OE étaient plus tolérantes à l'I3C et au Mtp que le contrôle, tandis que les lignées KO étaient plus sensibles à ces composés. Les activités d’enzymes de détoxication, les carboxylesterases (CE) et les glutathion S-transférases (GST), à l'égard de substrats modèles étaient accrues dans les lignées OE, alors qu'elles étaient diminuées dans les lignées KO. Des études récentes ont montré que l'activation de la voie de CncC:Maf est médiée par la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) lors d'un stress toxique. J’ai donc mesuré la production de ROS dans les cellules Sf9 traitées avec l’I3C et le Mtp. Les deux composés ont déclenché des pulses de ROS bien qu’à des niveaux limités dans les lignées OE, contrairement aux lignées KO pour lesquelles les niveaux de ROS étaient plus importants. L'utilisation d'un antioxydant a annulé les pulses de ROS et restauré la tolérance des cellules KO à l'I3C et au Mtp. Enfin, j’ai comparé les gènes différentiellement exprimés dans les lignées OE et KO lors une analyse transcriptomique (RNA-seq). Ceci m’a permis d'identifier les gènes potentiellement contrôlés par CncC et Maf, la plupart d'entre eux étant des gènes de détoxication dont le rôle dans la résistance aux insecticides et la métabolisation de composés de plantes a été démontrée dans plusieurs études. En conclusion, je présente ici de nouvelles données suggérant que la voie de signalisation CncC:Maf joue un rôle central dans l'adaptation des FAW aux composés environnementaux toxiques et aux insecticides. Ces connaissances aident à mieux comprendre les voies d'expression des gènes de détoxication et peuvent être utiles à la conception de nouveaux moyens de lutte contre les insectes en interférant avec ces voies et l'expression des gènes de détoxication.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03847877 , version 1 (10-11-2022)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03847877 , version 1

Citer

Dries Amezian. Employing an insect Sf9 cell model system of the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, to investigate the role of transcription factors on the expression of detoxification genes in response to xenobiotics. Molecular biology. Université Côte d'Azur, 2022. English. ⟨NNT : 2022COAZ6000⟩. ⟨tel-03847877⟩
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