Structural insights into the photoactivation and recovery of the Orange Carotenoid Protein obtained by time-resolved X-ray scattering and crystallography
Etude structurale du mécanisme de photoactivation de l’Orange Caroténoïde Protéine (OCP) par la diffusion aux petits angles et la cristallographie aux rayons X en temps résolue
Résumé
The Orange Carotenoid Protein (OCP), involved in energy-quenching of the cyanobacterial light-harvesting antennae, is a two-domain protein functionalized by a non-covalently bound keto-carotenoid. To elicit its photoprotection function, the protein must be photoactivated by a blue-green photon, triggering transition from an orange inactive “dark” state (OCPO) to a red photoactive “light” state (OCPR). The photoactivation mechanism, which spans 13 decades in time, involves structural rearrangements at the level of both the photoexcited carotenoid and the protein scaffold. During my thesis, I investigated rhe OCP photoactivation mechanism using variety of biochemistry and structural biology methods.Firstly, through combination of spectroscopy and steady-state and time-resolved (TR) X-ray scattering, we examined the large-scale motions involved in the photoactivation and recovery of OCP. We demonstrated that oligomerization occurs at both the OCPO and OCPR level, and that it partakes in the regulation of the protein photoactivation and thermal recovery. Secondly, by using conventional X-ray crystallography, we determined the previously-uncharacterized crystal structure of Planktothrix aghardii OCP. Structural analysis pointed to the influence of protein flexibility on the photoactivation and recovery rates, and on the energy-quenching activity of this variant. In an effort to characterize early stages of OCP photoactivation by means of TR crystallography, we investigated in vitro and in vivo crystallization methods to produce sub-micron-sized OCP crystals. Specifically, we attempted in vivo crystallization in the crystalliferous bacterium Bacillus thuringiensis (Bt), endeavoring to obtain crystals of fusions of OCP with Cyt1Aa and Cry11Aa Bt toxins. While unsuccessful in terms of production of OCP crystals, this work enabled to shed light on the structure and bioactivation cascade of the two toxins, and to investigate the molecular mechanisms at the basis of their crystallization.
L’Orange Caroténoïde Protéine (OCP) est une protéine à deux domaines stabilisés par la présence d’un pigment kéto-caroténoïde à leur interface. Chez la cyanobactérie, l’OCP joue un rôle de photoprotection, et est capable de se lier aux antennes collectrices de lumière, i.e. les phycobilisomes (PBS) et dissiper l’excès d’énergie collectée sous forme de chaleur. Pour exercer sa fonction de photoprotection la protéine doit être photoactivée, par absorption d’unphoton bleu-vert, ce qui déclenche sa transition d’un état orange inactif (OCPO) vers un état rouge photoactif (OCPR). Le mécanisme de photoactivation s’étend sur 13 échelles de temps et implique des changements structuraux au sein du caroténoïde et de la matrice protéique.En vue d’investiguer ces changements, au cours de ma thèse j’ai étudié le mécanisme de photoactivation d’OCP en utilisant diverses méthodes de biochimie et de la biologie structurale. Tout d’abord, en combinant la spectroscopie et la diffusion des rayons X en mode stationnaire et résolue en temps (TR), nous avons investigué les réarrangements conformationnels à grande échelle impliqués dans la photoactivation et le retour thermique de l’OCP. Nous avons démontré que l’OCPO et l’OCPR peuvent oligomériser, et que les processus d’oligomérisation participent à la régulation du photocycle de la protéine. Deuxièmement, en utilisant lacristallographie aux rayons X, nous avons déterminé la structure de l’OCP synthétisé chez la cyanobacterie Planktothrix agardhii, auparavant non caractérisée. Notre analyse a renseigné sur comment la flexibilité structurale de cette variante influence son activité d’extinction d’énergie, ainsi que sa vitesse de photoactivation et relaxation. En utilisant la cristallographie résolue en temps, nous avons caractérisé les premières étapes de photoactivation de l’OCP. Nous avons utilisé des méthodes de cristallisation in vitro et in vivo pour produire des cristauxOCP de taille nanométrique. Nous avons investigué la cristallisation in vivo dans la bactérie Bacillus thuringiensis (Bt), à dessein d’obtenir des cristaux de fusion de l’OCP avec deux toxines de Bt naturellement cristallines, la Cyt1Aa et la Cry11Aa. En termes de production de cristaux d’OCP, ce travail a été sans succès, néanmoins il a permis d’étudier la structure et la cascade de bioactivation de ces deux toxines, ainsi que d’élucider les mécanismes moléculaires qui sont à la base de leur cristallisation in vivo.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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