HSP90 a dynamic therapeutic target : modulation of populated conformations upon ligand binding
HSP90 une cible thérapeutique dynamique : modulation des conformations peuplées par la liaison de ligands
Résumé
HSP90 is a major chaperone engaged in the folding, stabilization and aggregation prevention of a plethora of client proteins. Among HSP90 clients are found numerous oncoproteins implicated in the hallmarks of cancer. Additionally, it has also been reported that a high level of HSP90 protein was observed in a large number of cancers suggesting a paramount role of HSP90 in survival and growth of cancer cells. Hence, HSP90 has been reported as a target for the development of ligands for therapeutic use. HSP90 is a very flexible protein, thus a challenging target, showing structural variability, especially on its ATP-lid covering the nucleotide/drug binding site, as pointed out by more than 300 crystallographic structures of the N-terminal domain of HSP90. For drug design studies, it is crucial to characterize the exact structure of the ATP-lid segment but also to investigate its dynamics as it was shown to play a role both in the kinetics and thermodynamics of the ligand binding.In the here presented study, I used solution NMR spectroscopy to characterize the 26 kDa ATP-binding domain of human HSP90a. Employing advanced isotopic labeling techniques on methyl groups I managed to assign all resonances of the N-terminal domain of HSP90 and demonstrated that the ATP-lid was in exchange between two conformations in the µs-ms timescale. Both structures of the major and minor states were elucidated. While the major state is found with the ATP-lid in an open position as expected from the previously determined X-ray structures of HSP90 N-terminal domain, it was established that the ATP-lid also samples a closed conformation distant by up to 30 Å from the major state. This is the first time that this important structural change, involved in HSP90 functional cycle, is observed in the N-terminal domain of apo HSP90. Using NMR CPMG relaxation dispersion experiments, I characterized both kinetically and thermodynamically the exchange between the open and closed states of the N-terminal domain of apo HSP90.I next investigated how two resorcinol derivatives modulate the energy landscape of HSP90. I could show that even though both ligands share a comparable chemical structure and a similar affinity towards HSP90, they differently modulate both structure and dynamics of their target protein. One of the two ligands binds to the pre-existing open conformation of the N-terminal domain of HSP90 and speeds up the exchange with the closed ATP-lid domain compared to the apo protein. On the contrary, the second ligand, differing only by one substituent, induces the formation of a new helix in the ATP-lid major state conformation and has a residence time on target increased by two orders of magnitude. While this ligand induces a new major state conformation, it also slows down the ATP-lid conformational exchange. These results bring a structural basis to understand target protein conformational dynamics’ role in binding of a potential drug candidate.
HSP90 est une protéine chaperonne fondamentale, engagée dans le repliement, la stabilisation et la prévention de l’agrégation d’une multitude de protéines clientes. Parmi les protéines clientes de HSP90, on retrouve un nombre important d’oncoprotéines impliquées dans les marqueurs caractéristiques du cancer. De plus, il a également été reporté qu’un niveau élevé de protéine HSP90 était observé dans un grand nombre de cancers suggérant un rôle primordial de HSP90 dans la survie et la croissance de cellules cancéreuses. Ainsi, la chaperonne moléculaire a été reportée comme cible pour le développement de ligands à visée thérapeutique. HSP90 est une protéine très flexible, donc une cible complexe, montrant une variabilité structurale et ce, particulièrement au niveau de l’ATP-lid, segment à proximité du site de fixation des nucléotides/candidats médicaments, comme révélé par plus de 300 structures cristallographiques. Pour les études de conception de médicaments, il est crucial de caractériser la structure exacte de l’ATP-lid mais également d’étudier sa dynamique, cette dernière ayant un rôle clé à la fois sur la cinétique et la thermodynamique de la liaison d’un ligand.Dans l’étude présentée ici j’ai utilisé la spectroscopie RMN en solution pour caractériser le domaine N-terminal de HSP90a humaine de 26 kDa. En employant des techniques de marquages isotopiques avancées sur les groupements méthyles j’ai pu attribuer l’ensemble des fréquences du domaine N-terminal de HSP90 et démontrer que l’ATP-lid était en échange entre deux conformations dans la gamme de temps µs-ms. Les structures de l’état majoritaire et de l’état minoritaire ont été élucidées. Tandis que l’état majoritaire peuple une conformation avec l’ATP-lid en position ouverte comme attendu d’après les structures cristallographiques disponibles du domaine N-terminal de HSP90, l’état minoritaire échantillonne une conformation fermée, distante de plus de 30 Å de l’état ouvert majoritaire. C’est la première fois que ce changement structural important, impliqué dans le cycle fonctionnel de HSP90, est observé pour le domaine N-terminal isolé de HSP90. En utilisant des expériences RMN de CPMG relaxation-dispersion, j’ai pu caractériser à la fois cinétiquement et thermodynamiquement l’échange entre les états ouvert et fermé du domaine N-terminal de HSP90 apo.J’ai ensuite étudié l’influence de deux inhibiteurs, dérivés de la famille du résorcinol, sur le paysage énergétique de HSP90. J’ai pu montrer que bien que les deux ligands partagent une structure chimique comparable et une affinité similaire envers HSP90, ils modulent différemment la structure et la dynamique de leur protéine cible. L’un des ligands se lie à la conformation préexistante ouverte du domaine N-terminal de HSP90 et accélère l’échange avec l’état fermé par rapport à la protéine apo. A l’inverse, le second ligand, différant uniquement par un substituant, induit la formation d’une nouvelle hélice dans l’état majoritaire avec l’ATP-lid en position ouverte et possède un temps de résidence sur sa cible multiplié par 100. De plus, ce ligand induisant une nouvelle conformation fondamentale de la protéine décélère l’échange conformationnel. Ces résultats apportent une base structurale pour comprendre le rôle de la dynamique conformationnelle de la protéine cible dans la liaison d’un potentiel candidat médicament.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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