ln vivo and in toto imaging for the reconstruction of multilevel dynamics in embryonic morphogenesis - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2022

ln vivo and in toto imaging for the reconstruction of multilevel dynamics in embryonic morphogenesis

Imagerie in vivo et in toto pour la reconstruction des dynamiques multiniveaux dans la morphogenèse embryonnaire

Svetlana Jovanic
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1235180
  • IdRef : 261816993

Résumé

In human, malfunctions during early developmental processes have strong implications that often compromise the survival of the embryo. We need to understand developmental processes at the level of cell behaviours and cell signalling to anticipate deleterious effects and to find potential treatments. Thanks to the high evolutionary conservation of biological processes, this can be achieved in chosen animal models and organoids.Our first goal is methodological to observe in vivo and in toto, reconstruct and quantify cell behaviours in early embryogenesis in a mammalian species - rabbit Oryctolagus cuniculus - and a non-mammalian vertebrate - zebrafish Danio rerio. Our methodology is then used to investigate fundamental cell behaviours that underlie zebrafish gastrulation in normal conditions and upon perturbations.We overcame bottlenecks to image live rabbit embryos with a prototype of an upright light sheet microscope developed by PhaseView according to our specifications. We designed 3D printed chambers for in toto imaging of mammalian early embryogenesis that allow high resolution 3D+time imaging at pre-implantation stages. Our methodology provides high quality imaging data for accurate and precise reconstruction of cell lineages and cell contours.Despite extensive work from different laboratories, the complete cell clonal history of the zebrafish embryo is not yet known because of imaging limitations. We worked to optimise embryo mounting, light sheet imaging with custom designed microscopes (PhaseView and ICFO Barcelona) and image processing. We conclude that for now, the size of the zebrafish embryo remains a major obstacle that cannot even be overcome with the image acquisition, reconstruction and fusion of two halves. Embryoids obtained from embryos devoid of yolk are smaller. We investigated their resilience through gastrulation. We established a controlled and reproducible strategy to make embryoids from 256-cell stage zebrafish embryos. They develop and elongate in a simple saline medium with a success rate of 80%. We distinguish between processes retained by embryoids and those dependent on the topological constraints of the intact embryo based on 3D+time imaging and quantitative analysis of cell displacements and cell lineage. Cells in embryoids keep their proliferation rate and cell mixing behaviour. Embryoids elongate a tail-like structure without convergence movements towards a midline. Elongation is largely impaired in MZoep mutants devoid of Nodal signalling transduction. Elongation observed in 29.7% of MZoep embryoids is delayed and limited in length. Cells do not invaginate or ingress in embryoids unless they overexpress Nodal signalling upon injection at the 16-cell stage of a constitutively active form of Nodal type I receptor acvr1ba*. As in normal embryos where it promotes axis duplication, acvr1ba* mRNA injection can lead to two tail like extensions. Induced ones express the fluorescent reporter of the goosecoid transcription factor.Our work is a step towards the possibility to better integrate molecular and cellular processes that underlie early morphogenesis. Embryoids challenge the robustness of developmental paths. Gain and loss of Nodal function in embryoids point to its implication in cell motility and tissue cohesiveness likely to be involved in the invagination process. In the absence of nutrients, cells in embryoids massively die around 11 hpf. This corresponds to our observation of the limit size of the cells after 13-14 cell cycles. Cells in embryoids undergo differentiation at later stages. With food supply, they might be a useful model to further investigate morphogenesis and differentiation.
Chez l'homme, les dysfonctionnements du développement précoce compromettent la survie de l'embryon. Nous devons comprendre les processus cellulaires et moléculaires en jeu pour anticiper les effets délétères et trouver des traitements.Du fait de la conservation évolutive des processus biologiques, cela peut être réalisé dans des modèles animaux et des organoïdes dérivés d’embryons précoces. Notre premier objectif a été d’observer in vivo et in toto, reconstruire et quantifier les comportements cellulaires au début de l'embryogenèse chez une espèce de mammifère - le lapin Oryctolagus cuniculus - et un vertébré non mammifère - le poisson zébré Danio rerio. Il s’agit ensuite d’étudier les comportements cellulaires qui sous-tendent la gastrulation du poisson zébré dans des conditions normales et lors de perturbations. Nous avons surmonté les obstacles pour imager des embryons de lapin vivants avec un prototype de microscope à feuille de lumière développé par l’entreprise PhaseView selon nos spécifications. Nous avons conçu des chambres imprimées en 3D pour l'imagerie in toto de l'embryogenèse précoce de mammifères qui permettent une imagerie 3D+temps haute résolution. Notre méthodologie fournit des données d'imagerie pour une reconstruction précise des lignages et des contours cellulaires. Malgré les tentatives de plusieurs laboratoires, l'histoire clonale des cellules de l'embryon de poisson zébré n'est pas encore connue en raison des limites de l'imagerie. Nous avons optimisé le montage d'embryons, l'imagerie à feuille de lumière avec (prototypes PhaseView et ICFO Barcelona) et le traitement d'images. La taille de l'embryon de poisson zébré reste un obstacle même avec le recollement des deux moitiés de l’embryon. Les embryoïdes obtenus à partir d'embryons dépourvus de vitellus sont plus petits. Nous avons étudié leur résilience au cours de la gastrulation. Nous avons établi une stratégie contrôlée et reproductible pour fabriquer des embryoïdes à partir d'embryons au stade 256 cellules. Ils s'allongent en milieu salin avec un taux de réussite de 80%. L'analyse quantitative des déplacements et du lignage cellulaire à partir d’images 3D+temps permet de distinguer les processus de la morphogenèse en jeu dans les embryoïdes et ceux dépendant de la topologie de l'embryon. Les cellules des embryoïdes conservent leur taux de prolifération et leur comportement de mélange cellulaire. Les embryoïdes allongent une structure de type caudal sans convergence vers une ligne médiane. L'élongation est altérée chez les mutants MZoep dépourvus de transduction Nodal. L'allongement observé chez 29,7 % des embryoïdes MZoep est retardé et limité. Dans les embryoides, les cellules ne s'invaginent et ne délaminent pas sauf si elles surexpriment la signalisation Nodal par injection au stade 16 cellules d'une forme constitutivement active du récepteur Nodal de type I acvr1ba*. Comme dans les embryons normaux où elle induit la duplication de l'axe embryonnaire, l'injection d'ARNm acvr1ba* peut conduire à deux extensions caudales. Les excroissances induites expriment le rapporteur fluorescent du facteur de transcription Goosecoïd. Notre travail est une étape vers l’intégration des processus moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la morphogenèse précoce. Les embryoïdes révèlent la robustesse du développement et les possibilités de résilience de l’organisme. Le gain et la perte de la fonction Nodal chez les embryoïdes indiquent son implication dans la motilité cellulaire et la cohésion tissulaire probablement impliquée dans le processus d'invagination.En l'absence de nutriments, les cellules des embryoïdes meurent massivement vers 11 hpf. Cela correspond à notre observation de la taille limite des cellules après 13-14 cycles cellulaires. Ces cellules se différencient ultérieurement. Avec l’apport de nutriments, les embryoides seront un modèle d’étude de la morphogenèse et de la différenciation qui conduisent à l’organisme.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04020535 , version 1 (09-03-2023)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04020535 , version 1

Citer

Svetlana Jovanic. ln vivo and in toto imaging for the reconstruction of multilevel dynamics in embryonic morphogenesis. Morphogenesis. Université Paris-Saclay, 2022. English. ⟨NNT : 2022UPASL014⟩. ⟨tel-04020535⟩
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