Mechanically-induiced differentiation of stem cells in three dimensions by quantitative optical imaging study
Différenciation induite mécaniquement de cellules souches à trois dimensions : étude par imagerie optique quantitative.
Résumé
A stem cell is a cell that has the ability to self-renew and differentiate into specialised cells. Placed in its microenvironment, a stem cell is exposed to a myriad of chemical and physical cues that regulate its cellular fate. Numerous studies, performed in vitro on individual cells or cell monolayers, have highlighted the crucial role of external forces or mechanical properties of substrates in triggering and guiding cell differentiation via mechanostransduction or mechanosensation processes, some of whose molecular players have been elucidated. The validation or disproof of these mechanisms in a three-dimensional (3D) environment, which more faithfully recapitulates the architecture of biological tissues, requires however the development of new approaches. Indeed, there is no longer a substrate as such, and the question arises as how to apply these forces for a sufficient duration to influence differentiation.Our strategy is to generate organoids encapsulated in transparent, permeable and elastic hydrogel shells. This 3D cell culture system allows to study organoid growth under free or elastically confined growth conditions by optical microscopy. To perform real-time monitoring of differentiation, we selected adipose stem cells (or pre-adipocytes), which have the peculiarity of drastically increasing in volume (hypertrophy) because of the appearance and accumulation of lipid droplets during their differentiation into adipocytes. Thus, the growth of the organoid is a priori determined by the combination of two effects: the increase in the number of adipose stem cells by proliferation and the increase in cell volume of the differentiating pre-adipocytes. Using an all-optical method combining morphometric monitoring by phase contrast microscopy and structural monitoring by fluorescence optical sectioning microscopy, we have shown, in the absence of a chemical adipogenic cue, that cell proliferation is considerably reduced in 3D compared to 2D and that the differentiation process of adipose stem cells is solely triggered by aggregation upon organoid formation. Whereas this "spontaneous" differentiation only occurs in 2D once confluence is reached and proliferation has stopped completely, organoid formation intrinsically places the cells in a confluent context. In conclusion, through the development of a methodological pipeline for the analysis of differentiating organoids, we provide new evidence for the crucial influence of dimensionality on cell fate in a case study. Finally, this thesis work ends with an independent exploratory part around new encapsulation methods aiming at designing hydrogel capsules with a wider variety of physicochemical properties.
Une cellule souche est une cellule qui a la capacité de s'auto-renouveler, de se multiplier à l'infini et de se différencier en des cellules spécialisées. Placée dans son microenvironnement, elle est soumise à une myriade de signaux chimiques et physiques qui régulent son destin cellulaire. De nombreuses études, conduites in vitro sur des cellules souches isolées ou en monocouche, ont mis en évidence le rôle crucial des forces extérieures ou des propriétés mécaniques des substrats dans le déclenchement et l’orientation de la différenciation cellulaire via des processus de mécanotransduction ou mécanosensation dont certains acteurs moléculaires ont été élucidés. La validation ou infirmation de ces mécanismes dans un environnement tridimensionnel (3D), qui récapitule plus fidèlement l’architecture des tissus biologiques, exige cependant le développement de nouvelles approches. En effet, il n’y a plus de substrat proprement dit, et comment appliquer ces forces pendant une durée suffisante pour influencer la différenciation.Notre stratégie est de générer des organoïdes encapsulés dans des coques d'hydrogel transparentes, perméables et élastiques. Ce système de culture cellulaire à 3D nous permet d’étudier par microscopie optique la croissance de l’organoïde en conditions de croissance libre ou confinée élastiquement. Pour permettre le suivi en temps réel de la différenciation, nous avons choisi comme système cellulaire d’étude des cellules souches adipeuses (ou pré-adipocytes) qui ont la particularité de subir une forte augmentation de volume (hypertrophie) due à l’apparition et l’accumulation de gouttelettes lipidiques au cours de leur différenciation en adipocytes. Ainsi, la croissance de l’organoïde est a priori déterminée par la combinaison de deux effets : l’augmentation du nombre de cellules souches adipeuses par prolifération et l’augmentation du volume cellulaire des pré-adipocytes en cours de différenciation. Par une méthode tout-optique associant suivi morphométrique par microscopie à contraste de phase et suivi structural par microscopie de fluorescence à sectionnement optique, nous avons montré, en l’absence de signal chimique adipogénique, que la prolifération cellulaire est considérablement réduite à 3D par rapport à 2D et que le processus de différenciation des cellules souches adipeuses est déclenché par simple agrégation dès la formation de l’organoïde. Alors que cette différenciation « spontanée » n’apparait à 2D qu’une fois la confluence atteinte et la prolifération complètement arrêtée, la formation d’un organoïde place intrinsèquement les cellules dans un contexte de confluence. En bref, par le développement d’une pipeline méthodologique d’analyse d’organoïdes en cours de différenciation, nous apportons, sur une étude de cas, une preuve nouvelle de l’influence cruciale de la dimensionalité sur le destin cellulaire. Enfin, ce travail se termine par une partie exploratoire indépendante autour de nouvelles méthodes d’encapsulation visant à concevoir des capsules d’hydrogel présentant une plus grande variété de propriétés physico-chimiques.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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