Structure-function relationship of FUS, an RNA-binding protein, in DNA repair - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2023

Structure-function relationship of FUS, an RNA-binding protein, in DNA repair

Relation structure-fonction de FUS, une protéine de liaison à l'ARN, dans la réparation de l'ADN

Résumé

Cells have evolved complex repair mechanisms to maintain the integrity of their genomes, and one of these mechanisms involves the PARP-1 enzyme and the synthesis of poly(ADP-ribose) (PAR). PARP-1 is recruited to the sites of DNA damage, where it synthesizes long negatively charged PAR chains attached to itself and other acceptor proteins. The PAR chains then act as a scaffold for the recruitment of other proteins, such as DNA repair factors, which are required for proper DNA repair.In recent studies, various RNA-binding proteins (RBPs) have been found to play a role in DNA repair. When considering DNA repair mechanisms that are dependent on PARP-1 activation, it appears that members of the FET family, particularly FUS, play a central role. FUS is recruited to DNA damage sites after laser beam exposure, and this recruitment depends on PARP-1 activity. FUS was identified in mass-spectrometry analyses of PARylated proteins following genotoxic stress and was shown to interact directly with PAR. In addition, FUS was shown to form the compartments through the interactions occurring between its low-complexity domains. Particularly, the formation of such compartments was observed at DNA damage sites following PARP-1 activation.The aim of this study is to investigate the biological functions of FUS in DNA repair mechanisms related to PARP-1 activation. FUS is known to participate in transcription by interacting with the C-terminal domain of RNA pol II and binding to nascent mRNA. Given that DNA damages often occur in open, transcriptionally-active chromatin, FUS is located in close proximity to DNA damage sites and can be rapidly directed to them. In this regard, the first question addressed in this study was the link between transcription and DNA repair in the context of FUS functions in the nucleus. Secondly, we asked whether FUS's function in PARP-1-dependent DNA repair is based on its ability to bind PAR. While other RNA-binding proteins can also bind to PAR through electrostatic interactions, FUS has a unique propensity for binding to and being PARylated. Therefore, understanding the structural characteristics that make FUS unique among other RNA-binding proteins and the nature of FUS-PAR interactions can help shed light on its role in DNA repair.In this study, we utilized a structural approach to demonstrate the specific interaction of the single RRM domain of FUS with protein-free PAR. Unlike other RNA-binding proteins, FET protein RRMs lack several aromatic residues that usually interact with RNA bases. Our NMR spectroscopy analysis shows that this provides a basis for the similar interaction of FUS RRM with RNA and PAR. Furthermore, we investigated whether FUS plays a role in controlling the overall level of PAR in the nucleus of HeLa cells following oxidative stress and transcription arrest. Our results indicate that FUS can significantly increase the level of PARylation in cells exposed to mild concentrations of hydrogen peroxide, an oxidative stress agent known to strongly activate PARP-1. This finding is consistent with the link between transcription and DNA repair, as stalling transcription significantly increases the capacity of FUS to increase the PAR level in HeLa cells exposed to hydrogen peroxide. Additionally, we identified certain residues located in the RRM of FUS, previously identified as PARylated, that control the autoPARylation of PARP-1 in vitro and the level of PARP-1 activity in cells. Overall, these results provide a basis for understanding the specific role of FUS in PARP-1-related DNA repair mechanisms.
Les cellules ont développé des mécanismes de réparation complexes pour maintenir l'intégrité de leurs génomes, et l'un de ces mécanismes implique l'enzyme PARP-1 et la synthèse de poly(ADP-ribose) (PAR). PARP-1 est recruté sur les sites de dommages à l'ADN, où il synthétise de longues chaînes PAR chargées négativement attachées à lui-même et à d'autres protéines. Les chaînes PAR agissent alors comme un échafaudage pour le recrutement d'autres protéines, qui sont nécessaires à une réparation correcte de l'ADN.Dans des études récentes, diverses protéines de liaison à l'ARN se sont avérées jouer un rôle dans la réparation de l'ADN. Lorsque l'on considère les mécanismes de réparation de l'ADN qui dépendent de l'activation de PARP-1, il semble que les membres de la famille FET, en particulier FUS, jouent un rôle central. FUS est recruté sur les sites de dommages à l'ADN après exposition au faisceau laser. Il a été identifié dans des analyses par spectrométrie de masse de protéines PARylées suite à un stress génotoxique et il a été démontré qu'il interagit directement avec le PAR. De plus, FUS a été démontré comme formant des compartiments grâce à des interactions entre ses domaines de faible complexité, comme observé au niveau des sites de dommages à l'ADN suite à l'activation de PARP-1.Le but de cette étude est d'étudier les fonctions biologiques de FUS dans les mécanismes de réparation de l'ADN liés à l'activation de PARP-1. FUS est connu pour participer à la transcription en interagissant avec l'ARN Pol II et en se liant à l'ARNm naissant. Étant donné que les dommages à l'ADN se produisent souvent dans la chromatine ouverte et transcriptionnellement active, FUS est situé à proximité des sites de dommages à l'ADN et peut être rapidement dirigé vers eux. À cet égard, la première question abordée dans cette étude était le lien entre la transcription et la réparation de l'ADN dans le contexte des fonctions FUS dans le noyau. Deuxièmement, la fonction de FUS dans la réparation de l'ADN dépendante de PARP-1 est basée sur sa capacité à se lier à PAR. Alors que d'autres protéines de liaison à l'ARN peuvent également se lier au PAR par le biais d'interactions électrostatiques, FUS a une propension unique à se lier et à être PARylé. Par conséquent, comprendre les caractéristiques structurelles qui rendent FUS unique parmi les autres protéines de liaison à l'ARN et la nature des interactions FUS-PAR peut aider à faire la lumière sur son rôle dans la réparation de l'ADN.Dans cette étude, nous avons utilisé une approche structurelle pour démontrer l'interaction spécifique du domaine RRM unique de FUS avec PAR. Contrairement à d'autres protéines de liaison à l'ARN, les RRM de FUS manquent de résidus aromatiques qui interagissent généralement avec les bases de l'ARN. Notre analyse par spectroscopie RMN montre que cela fournit une base pour l'interaction similaire du FUS RRM avec l'ARN et le PAR. De plus, nous avons cherché à savoir si FUS jouait un rôle dans le contrôle du niveau global de PAR dans le noyau des cellules HeLa suite au stress oxydatif et à l'arrêt de la transcription. Nos résultats indiquent que FUS peut augmenter de manière significative le niveau de PARylation dans les cellules exposées à de faibles concentrations de peroxyde d'hydrogène, un agent de stress oxydatif connu pour activer fortement PARP-1. Cette découverte est cohérente avec le lien entre la transcription et la réparation de l'ADN, car le blocage de la transcription augmente considérablement la capacité de FUS à augmenter le niveau de PAR dans les cellules HeLa exposées au peroxyde d'hydrogène. De plus, nous avons identifié certains résidus situés dans le RRM de FUS, précédemment identifiés comme PARylés, qui contrôlent l'autoPARylation de PARP-1 in vitro et le niveau d'activité de PARP-1 dans les cellules. Dans l'ensemble, ces résultats fournissent une base pour comprendre le rôle spécifique de FUS dans les mécanismes de réparation de l'ADN liés à PARP-1.
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Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04195352 , version 1 (04-09-2023)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04195352 , version 1

Citer

Evgeniya Mamontova. Structure-function relationship of FUS, an RNA-binding protein, in DNA repair. Molecular biology. Université Paris-Saclay; Novosibirsk State Technical University (Novosibirsk, Russie), 2023. English. ⟨NNT : 2023UPASL051⟩. ⟨tel-04195352⟩
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