Engineering and compartmentalisation of a synthetic methanol utilisation pathway in E. coli. - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2021

Engineering and compartmentalisation of a synthetic methanol utilisation pathway in E. coli.

Ingénierie et compartimentation d'une voie synthétique d'utilisation du méthanol chez E. coli

Camille Peiro
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1285919
  • IdRef : 263617351

Résumé

To overcome the issue faced in white biotechnology of using specific carbon sources for the microbial production of value-added compounds, more sustainable and cost-efficient substrates are needed. One-carbon (C1) compounds such as methanol have recently gained attention as substitutes for substrates competing with conventional food supply. Methanol can now be produced renewably from electricity, water or CO2 . Natural methylotrophs can grow on methanol but their full implementation in industrial processes is still limited by a lack of genetic tools. Therefore, efforts have been made to generate synthetic methylotrophs by transferring this metabolic trait into established bacterial production hosts (e.g. E. coli or C. glutamicum). Here, we shaped, implemented and compartmentalised a novel synthetic methanol utilisation (MUT) pathway in E. coli. The hybrid MUT pathway is composed of a bacterial NAD-dependent methanol dehydrogenase (Mdh) and a yeast dihydroxyacetone synthase (Das). First, we shaped the metabolic network of E. coli to fit the acquired methylotrophic properties. Dihydroxyacetone (DHA), a metabolite resulting from Das activity, is a natural carbon source for E. coli but its native metabolism remains unclear. Using constrain-based modelling, we found that DHA metabolism was suboptimal in E. coli. In addition, we deciphered enzymes involved in DHA metabolism and identified some bottlenecks in DHA assimilation by a system-level analysis. We identified genetic targets enabling to improve DHA assimilation. Next, we implemented the MUT pathway in E. coli. We constructed a combinatorial library of mdh and das encoding genes coming from various organisms and tested it by following 13C-methanol incorporation at the PEP-level (i.e. a proxy for methanol assimilation). The highest level of incorporation of methanol into central metabolism intermediates (e.g. 22% into the PEP) was obtained using a variant composed of Mdh from A. gerneri and a codon-optimized version of Das from P. angusta. Methanol assimilation was tested in the chassis built previously with improved DHA assimilation. The final synthetic strain had 1.5 to 5.9 times higher methanol assimilation in intracellular metabolites and proteinogenic amino acids than the starting strain did. However, the resulting strain did not grow on pure methanol. Finally, to spatially optimise the in vivo operation of the MUT pathway, we constructed a methylotrophic bacterial microcompartment (mBMC) containing the selected combination of Mdh and Das. We compared the in vitro operation of the MUT pathway alone or encapsulated. We demonstrated that substrate channelling was improved when the MUT pathway was encapsulated into the BMC.Overall, these results broadened the repertoire of synthetic pathways for methanol assimilation while bringing new knowledge on the establishment synthetic methylotrophy in E. coli. It also represents a groundwork for the utilization of BMC as versatile micro-reactors for the encapsulation of synthetic metabolic pathways with direct applications for the assimilation of methanol.
Pour surmonter le problème rencontré dans la biotechnologie blanche concernant l’utilisation de sources carbonées spécifiques pour la production microbienne de composés d’intérêt, de nouveaux substrats plus durables et plus rentables sont nécessaires. Les composés à un seul carbone (C1) tels que le méthanol ont récemment gagné en intérêt comme substituts aux substrats conventionnels qui sont en concurrence pour l'alimentation humaine. Le méthanol peut à présent être produit de manière renouvelable à partir d'électricité, d'eau et de CO2. Les méthylotrophes naturels peuvent croître en assimilant le méthanol mais leur utilisation lors de procédés industriels est encore limitée par un manque d'outils génétiques. Par conséquent, des efforts ont été faits pour générer des méthylotrophes synthétiques en transférant ce trait métabolique chez des hôtes de production bactériens connus (tels que E. coli ou C. glutamicum). Ici, nous avons modifié, introduit et compartimenté une nouvelle voie synthétique d'utilisation du méthanol (MUT) chez E. coli. La voie hybride MUT est composée d'une méthanol déshydrogénase (Mdh) d’origine bactérienne dépendante du NAD et d'une dihydroxyacétone synthase (Das) provenant d’une levure. Le réseau métabolique d’E. coli a tout d’abord été modifié pour s’adapter aux propriétés méthylotrophiques acquises. Le dihydroxyacétone (DHA), un métabolite résultant de l'activité de la Das, est une source naturelle de carbone pour E. coli mais son métabolisme natif reste inconnu. En utilisant des outils de modélisation, nous avons constaté que le métabolisme du DHA n’était pas optimal chez E. coli. De plus, nous avons pu déterminer quelles enzymes étaient impliquées dans le métabolisme du DHA et avons identifié certains verrous métaboliques limitant l'assimilation du DHA grâce à une analyse à l’échelle du système. Nous avons aussi pu identifier des cibles génétiques permettant d’améliorer l'assimilation du DHA. Ensuite, la voie MUT a été introduite chez E. coli. Nous l'avons construite en élaborant une bibliothèque combinatoire de gènes provenant de divers organismes codant pour mdh et das et l'avons testée en suivant l'incorporation du 13C-méthanol au niveau du PEP (un proxy pour suivre l'assimilation du méthanol). Le plus haut niveau d'incorporation de méthanol dans les intermédiaires du métabolisme central (22% dans le PEP) a été obtenu en utilisant la combinaison composée de la Mdh d'A. gerneri et d'une version codon optimisée de la Das de P. angusta. Puis, l'assimilation du méthanol a été testée dans le châssis construit précédemment pour une assimilation améliorée du DHA. La souche synthétique finale a une assimilation du méthanol 1,5 à 5,9 fois plus élevée dans les métabolites intracellulaires et les acides aminés protéinogéniques que la souche de départ. Cependant, la souche finale ne pouvait toujours pas pousser sur du méthanol pur. Enfin, pour optimiser spatialement le fonctionnement de la voie MUT in vivo, nous avons construit un microcompartiment bactérien méthylotrophique (mBMC) contenant la meilleure combinaison de la Mdh et de la Das. Nous avons comparé le fonctionnement de la voie MUT seule ou encapsulée in vitro. Nous avons démontré que la conversion du substrat était améliorée lorsque la voie MUT était encapsulée dans le BMC.Dans l'ensemble, ces travaux ont élargi le répertoire des voies synthétiques permettant l'assimilation du méthanol, tout en apportant de nouvelles connaissances sur l'établissement de la méthylotrophie synthétique chez E. coli. Ils représentent également une base de départ pour l'utilisation des BMCs comme micro-réacteurs modulables pour l'encapsulation de voies métaboliques synthétiques avec des applications directes pour l'assimilation du méthanol.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04213514 , version 1 (21-09-2023)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04213514 , version 1

Citer

Camille Peiro. Engineering and compartmentalisation of a synthetic methanol utilisation pathway in E. coli.. Biochemistry [q-bio.BM]. INSA de Toulouse, 2021. English. ⟨NNT : 2021ISAT0043⟩. ⟨tel-04213514⟩
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