Production de HDL reconstituées à partir de Apolipoprotéine A-I recombinante, pour la vectorisation de molécules thérapeutiques - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2023

Production of reconstituted HDL from recombinant Apolipoprotein A-I for the vectorization of therapeutic molecules

Production de HDL reconstituées à partir de Apolipoprotéine A-I recombinante, pour la vectorisation de molécules thérapeutiques

Résumé

The beneficial properties of high-density lipoproteins (HDL) in the reduction of cardiovascular diseases are well recognized. Several clinical studies have shown that low plasma HDL levels are associated with the development of atherosclerosis and vascular complications. HDL exhibits several protective functions, such as the reverse cholesterol transport from peripheral tissues to the liver, as well as antioxidant and anti-inflammatory properties. The multiple protective functions of HDL appear to be carried out mainly by the lipoprotein's major protein component, apolipoprotein A-I (ApoA-I). HDL, via ApoA-I, are also natural nanoparticles with the ability to transport and vectorize numerous endogenous molecules such as alpha-1-antitrypsin (AAT), an enzyme with protective activity that can reduce the inflammatory processes involved in numerous vascular and respiratory pathologies. AAT inhibits the activity of proteases such as elastase, thereby reducing inflammation. All the protective functions of HDL, as well as their transport role, make these particles interesting nano-vectors for the development of new therapies. The aim of my thesis is to produce HDLs enriched with AAT, and to characterize their structural and functional anti-inflammatory properties, in an in vitro cell culture model and in vivo mouse model. In addition, the nanoparticles produced have been used to explore novel routes of administration such as inhalation, a highly targeted route for the treatment of vascular or pulmonary pathologies. To achieve these objectives, a recombinant ApoA-I (rApoA-I) was fused to a cleavable histidine tag in the bacterial strain Clear coli. After cleavage of the tag and purification by affinity chromatography, rApoA-I was characterized by SDS-PAGE electrophoresis and analyzed by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. The rHDL were prepared following a protocol using sodium cholate dialysis by combining purified and characterized ApoA-I with phosphatidylcholine in a 1:75 molar ratio. Dynamic light scattering and electron microscopy techniques revealed that the nanoparticles obtained were about 7 nm in size and had a morphology similar to the natural pre-β-HDL. Functional characterization on endothelial (EA. hy926) and epithelial (A549) cells showed rapid internalization of rHDL while preserving cell viability. In addition, EA. hy926 incubated with rHDL showed a decrease in the expression of the cytokine IL-6 and the adhesion molecule ICAM-1, attesting the anti-inflammatory and endothelial protection capacity of nanoparticles. In vivo, the bioavailability test performed on C57BL/6 mice revealed good uptake of rHDL nanoparticles by the lungs, 6 h after their administration by aerosolization. Enrichment of nanoparticles with AAT showed that even in the presence of modest enrichment, rHDL exhibited significant anti-inflammatory and endothelium-protecting activities, as well as significant anti-elastase activity, in vitro. In conclusion, my results showed that rHDL produced from recombinant ApoA-I exhibit protective effects. The homogeneous distribution of rHDL within the lungs and the absence of cytotoxicity suggest that they could be used to treat inflammatory lung diseases such as pulmonary emphysema. In addition, enrichment of rHDL with AAT showed that the enzyme's anti-elastase activity was preserved, a prerequisite for its anti-inflammatory role. Thus, the results of my thesis work provide important validation elements for the preparation and use of rHDL as nano-carriers for therapeutic compoundsadministered via the pulmonary route.
Les propriétés bénéfiques des lipoprotéines de haute densité (HDL) sont bien reconnues pour contrer les maladies cardiovasculaires. De nombreuses études cliniques montrent en effet qu’un faible taux plasmatique de HDL est associé à un développement accru de l’athérosclérose et des complications vasculaires associées. Les HDL présentent de nombreuses fonctions protectrices comme le transport inverse du cholestérol depuis les tissus périphériques vers le foie mais également des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires. Les fonctions protectrices multiples des HDL semblent portées par la protéine majeure, l'apolipoprotéine A-I (ApoA-I). Les HDL, via leur ApoA-I, constituent de véritables nanoparticules naturelles ayant la capacité à transporter et vectoriser les molécules endogènes comme l’alpha-1-antitrypsine (AAT), une enzyme exerçant une activité protectrice pouvant réduire les processus inflammatoires impliqués dans de nombreuses pathologies vasculaires ou respiratoires. L’AAT exerce une inhibition de l’activité de protéases comme l’élastase, réduisant ainsi l’inflammation. L’ensemble des fonctions protectrices des HDL, ainsi que leur rôle de transport font d’elles des nano vecteurs d’intérêt pour le développement de nouvelles thérapies. L’objectif de ma thèse est de produire des HDL enrichies en AAT et de caractériser leurs propriétés structurales et fonctionnelles, notamment leurs activités anti-inflammatoires protectrices sur un modèle cellulaire et in vivo chez la souris. Grâce aux nanoparticules (rHDL) produites, mon travail a également visé l’exploration de voies d'administration originales comme l'inhalation pour le traitement des pathologies vasculaires ou pulmonaires. Pour répondre à ces objectifs, l’ApoA-I recombinante (rApoA-I) fusionnée à une étiquette histidine clivable a été produite au sein de la bactérie Clear coli. Après clivage de l’étiquette et purification par chromatographie d’affinité, la caractérisation de rApoA-I a été réalisée par électrophorèse SDS-PAGE, spectrométrie de masse et résonance magnétique nucléaire. Les rHDL ont été constituées selon un protocole utilisant du cholate de sodium, en combinant l’ApoA-I purifiée et caractérisée avec de la phosphatidylcholine selon un ratio molaire 1 : 75. Les techniques de diffusion dynamique de la lumière et de microscopie électronique ont permis de déterminer une taille des rHDL d’environ 7 nm et une morphologie similaire aux pré-β-HDL naturelles. La caractérisation fonctionnelle sur des cellules endothéliales (EA.hy926) et épithéliales (A549) montre une capacité d’internalisation rapide des rHDL tout en préservant la viabilité cellulaire. De plus, une diminution de l’expression de la cytokine IL-6 et de la molécule d’adhésion ICAM-1 par les EA.hy926 incubées avec les rHDL atteste de leur capacité anti-inflammatoire et de protection endothéliale. In vivo, le test de biodisponibilité effectué chez la souris C57BL/6, révèle une bonne captation des rHDL par les poumons, 6 h après leur administration par aérosolisation. L’enrichissement des nanoparticules avec de l’AAT a démontré que même en présence d’un enrichissement modeste des rHDL, celles-ci présentent, in vitro, des activités anti-inflammatoires et de protection de l’endothélium significatives ainsi qu’une activité anti-élastase notable. Ces résultats montrent que les rHDL produites à partir d’ApoA-I recombinante présentent des effets protecteurs. De plus, l’enrichissement des rHDL avec l’AAT a permis de montrer que l’activité anti-élastase de l’enzyme nécessaire à son rôle anti-inflammatoire était préservée.. Ainsi, les résultats de mon travail de thèse apportent des éléments de validation importants pour la préparation et l’utilisation des rHDL comme nano vecteurs de composés thérapeutiques administrables par voie pulmonaire.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04220714 , version 1 (28-09-2023)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04220714 , version 1

Citer

Sarah Rosanaly. Production de HDL reconstituées à partir de Apolipoprotéine A-I recombinante, pour la vectorisation de molécules thérapeutiques. Biochimie, Biologie Moléculaire. Université de la Réunion, 2023. Français. ⟨NNT : 2023LARE0017⟩. ⟨tel-04220714⟩
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