All-optical neurophysiology with scanless two-photon excitation
Neurophysiologie tout-optique par excitation biphotonique sans-balayage
Résumé
Understanding the mechanisms underlying sensory perceptions requires, on one hand, to identify the neurons composing the networks involved, and on the other hand to decipher the spatial and temporal patterns of activation of the different cells in response to a stimulus. Electrophysiological methods have allowed neuroscientists to record and manipulate neuronal activity with high fidelity, but they suffer from poor spatial resolution or have a very low yield. The development of two-photon optogenetics in the last twenty years, along with new complex optical methods, has revolutionized the field of neuroscience by allowing to control as well as record the activity of neuronal populations with single cell resolution, in so-called all-optical experiments. During my thesis, I worked on the two-photon characterization of tools for both aspects of all-optical manipulation of neuronal circuits. First, in collaboration with the laboratories of Peter Hegemann and J. Simon Wiegert, I characterized a construct composed of an excitatory and an inhibitory rhodopsin (called BiPOLES) under two-photon excitation. Using Computer Generated Holography (CGH) illumination, organotypic hippocampal slices expressing the construct and electrophysiology, I determined the two-photon activation spectrum of the construct and identified the optimal wavelengths for photo-activation and -inhibition. I was able to show that action potentials could be photo-evoked in a reliable manner under 1100 nm illumination, and that 920 nm light inhibited both current- or photo-induced action potentials, via shunting inhibition. The second part of my thesis consisted of demonstrating the usability of scanless approaches for two-photon voltage imaging in densely labelled samples. Using organotypic hippocampal slices expressing the voltage indicator JEDI-2P and Generalized Phase Contrast (GPC) coupled to temporal focusing (TF) illumination, we were able to optically record single and trains of action potentials up to 125 Hz, with acquisition rates varying from 500 Hz to 1 kHz. We also showed that sub-threshold events (as small as 1 mV) were detectable by averaging. This was illustrated by recordings of spontaneous activity in single and multiple cells. Finally, by co-expression with the soma-localized rhodopsin ChroME-ST, we photo-evoked action potentials and recorded them, enabling to infer the precise timing of the firing of evoked action potentials.
Afin de comprendre les mécanismes qui sous-tendent les perceptions sensorielles, il est nécessaire, d'une part, d’identifier les neurones qui composent les réseaux concernés et, d'autre part, de déchiffrer les schémas spatiaux et temporels d'activation des différentes cellules en réponse à un stimulus. Les méthodes électrophysiologiques ont permis aux scientifiques d'enregistrer et de manipuler l'activité neuronale avec une grande fidélité, mais elles pâtissent d'une mauvaise résolution spatiale ou d'un rendement très faible. Le développement de l'optogénétique biphotonique au cours des vingt dernières années, ainsi que de nouvelles méthodes optiques complexes, a révolutionné le domaine des neurosciences en permettant de contrôler et d'enregistrer l'activité des populations neuronales avec une résolution cellulaire, dans des expériences dites "tout-optique". Au cours de ma thèse, j'ai travaillé sur la caractérisation biphotonique d'outils pour les deux aspects de la manipulation tout-optique des circuits neuronaux. Tout d'abord, en collaboration avec les laboratoires de Peter Hegemann et de J. Simon Wiegert, j'ai caractérisé une construction composée d'une rhodopsine excitatrice et d'une rhodopsine inhibitrice (appelée BiPOLES) sous excitation biphotonique. En utilisant l'illumination par holographie digitale (CGH), des tranches organotypiques d'hippocampe exprimant la construction et la technique du patch-clamp, j'ai exploré le spectre d'activation à deux photons de la construction et déterminé les longueurs d'onde optimales pour la photo-activation et l'inhibition. J'ai pu montrer que les potentiels d'action pouvaient être photo-évoqués de manière fiable à 1100 nm, et que la lumière de 920 nm permettait d'inhiber les potentiels d'action induits par le courant ou la lumière, via l'inhibition par shunting. La deuxième partie de ma thèse consistait à démontrer que les approches sans balayage pouvaient être utilisées pour l'imagerie de voltage biphotonique dans des échantillons densément marqués. En utilisant des tranches organotypiques d'hippocampe exprimant l'indicateur JEDI-2P et la technique de contraste de phase généralisé (GPC) couplé à l’approche de focalisation temporelle (TF), nous avons pu enregistrer optiquement des potentiels d'action uniques et des trains de potentiels d'action jusqu'à 125 Hz, à des vitesses d'acquisition variant de 500 Hz à 1 kHz. Nous avons également montré que les événements de faible amplitude (jusqu'à 1 mV) pouvaient être détectés en moyennant plusieurs répétitions. Des enregistrements d'activité spontanée de multiples cellules ont pu être réalisés. Enfin, en co-exprimant la rhodopsine ChroME-ST et JEDI-2P, nous avons photo-évoqué des potentiels d'action et les avons enregistrés, ce qui nous a permis de déduire le moment précis du déclenchement des potentiels d’action.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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