Transcriptomic characterization of endothelial cells from HHT and PAH patients carrying ALK1 mutations to propose new therapeutic approaches for these two vascular diseases - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2023

Transcriptomic characterization of endothelial cells from HHT and PAH patients carrying ALK1 mutations to propose new therapeutic approaches for these two vascular diseases

Caractérisation transcriptomique des cellules endothéliales de patients HHT et HTAP porteurs de mutations ALK1 pour proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces deux maladies vasculaires

Tala Al Tabosh
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1330580
  • IdRef : 272304220

Résumé

Activin receptor-Like Kinase 1 (ALK1) is a type 1 TGF-β family receptor that is predominantly expressed on endothelial cells (ECs) and binds with high affinity to bone morphogenetic proteins 9 and 10 (BMP9 and BMP10), inducing the phosphorylation of Smad1/5 transcription factors that subsequently regulate target gene expression. ALK1 signaling generally promotes vascular quiescence. Heterozygous loss-of-function mutations in ACVRL1 (encoding ALK1) are associated with the development of a rare genetic vascular disease called hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT). Very rarely, mutations in ACVRL1 have also been described in heritable pulmonary arterial hypertension (hPAH). Haploinsufficiency is the current model for these two diseases.The aim of this work was to characterize the transcriptomic response of primary ALK1-mutated ECs to BMP9 and BMP10 stimulation, in order to better understand the pathogenic molecular mechanisms underlying these two diseases and identify potential therapeutic targets.Endothelial colony-forming cells (ECFCs) and microvascular endothelial cells (MVECs) carrying heterozygous loss-of-function ALK1 mutations were isolated from cord blood of newborn HHT donors and explanted lungs of PAH patients, respectively. RNA-sequencing was performed on each type of cells compared to control counterparts following an overnight stimulation with BMP9 or BMP10. In both EC control models, BMP9 and BMP10 stimulations induced very similar transcriptomic responses with nearly no differentially expressed genes (DEGs) between BMP9 and BMP10 stimulation. Surprisingly, comparison of the transcriptome between control and ALK1-mutated ECFCs revealed very similar profiles, both at the baseline and upon stimulation with BMP9 or BMP10. Consistently, control and ALK1 mutated ECFCs displayed a similar activation level of Smad1/5 by BMP9, which could not be explained by a compensation in cell-surface ALK1 levels. On the other hand, ALK1-mutated PAH HMVECs, derived from a sick environment, revealed, already at the baseline, a strong transcriptional dysregulations compared to controls, with >1200 DEGs. Two-factor differential expression analysis, which takes into account the two involved variables (ALK1 genotype and BMP stimulation), identified 44 protein-coding genes with impaired regulation by BMP9 in ALK1-mutated HMVECs, but none in ALK1-mutated ECFCs. We focused on 6 of them (LFNG, JAG2, TNFRSF1B, SLC6A6, SOX13 and CEBPG) and found that at least one, LFNG, encoding lunatic fringe, which is a modulator of Notch signaling, could be validated by RT-qPCR on ALK1-mutated HMVECs, ECFCs and HUVECs (Human Umbilical Vein ECs; isolated from HHT newborns).This work reveals that ALK1 heterozygosity does not impair Smad1/5 activation nor strongly affect the transcriptomic response to BMP9 or BMP10, which were shown to exert equivalent transcriptomic roles in vitro. Nevertheless, more in depth bioinformatic analysis highlighted few genes exhibiting impaired regulation by BMP9/BMP10 even in newborn cells. The paucity of transcriptomic dysregulations in mutated ECFCs indicates that the overt changes observed in mutated HMVECs cannot be solely attributed to ALK1 heterozygosity, but might additionally involve second hits (somatic mutation/ inflammation/ angiogenesis) potentially present in the sick lungs of endstage PAH patients. In conclusion, these findings challenge the haploinsufficiency model for HHT and PAH, and favor the notion that a second hit might be necessary for driving vascular pathogenesis, while highlighting few potential therapeutic targets (like LFNG) that could be highly sensitive to reduction in functional ALK1 levels and might act as priming events for early disease onset.
Activin receptor-Like Kinase 1 (ALK1) est un récepteur de la famille des TGF-β exprimé principalement dans les cellules endothéliales (CE) et qui lie avec une grande affinité les BMP (Bone Morphogenetic Protein) 9 et 10 (BMP9 et BMP10), induisant la phosphorylation des facteurs de transcription Smad1/5 qui régulent ensuite l’expression de gènes cibles. Le rôle de la signalisation ALK1 est de contribuer à la quiescence vasculaire. Les mutations hétérozygotes perte de fonction du gène ACVRL1 (codant pour ALK1) sont associées au développement de deux maladies vasculaires rares : la télangiectasie hémorragique héréditaire (HHT) et, plus rarement, l'hypertension artérielle pulmonaire héréditaire (HTAP) dont l’haploinsuffisance est le modèle actuel. L'objectif de ce travail est de caractériser la réponse transcriptomique de CE primaires mutées pour ALK1 après stimulation par BMP9 et BMP10, afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires pathogènes et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles.Des CE formant des colonies (ECFC) et des CE microvasculaires (HMVEC) portant des mutations hétérozygotes perte de fonction pour ALK1 ont été respectivement isolées à partir du sang de cordon de donneurs nouveau-nés HHT et de poumons explantés de patients atteints d'HTAP. Chaque type cellulaire, ECFC et HMVEC a été stimulé pendant 18h avec du BMP9 ou du BMP10, l’ARN a ensuite été séquencé et les niveaux d’expression comparés à ceux de cellules témoins saines. Dans les deux modèles EC, les stimulations BMP9 et BMP10 ont induit des réponses transcriptomiques très similaires avec peu de gènes différentiellement exprimés (DEGs) entre les deux ligands. La comparaison du transcriptome entre les ECFC témoins et mutés par ALK1 a également révélé des profils similaires, au niveau basal et lors de la stimulation avec du BMP9 ou du BMP10. De plus, les ECFC témoins et mutés activent de la même manière la voie de signalisation Smad1/5 en réponse au BMP9, et ce résultat n’a pas pu être expliqué par une compensation des niveaux d'ALK1 à la surface cellulaire. En revanche, les HMVEC HTAP mutées, issues d'un environnement malade, présentent de fortes dérégulations transcriptionnelles par rapport aux témoins, avec plus de 1200 DEGs à l’état basal. Une analyse de l'expression différentielle à deux facteurs, prenant en compte les deux variables (génotype et stimulation), a permis d’identifier 44 gènes codant pour des protéines avec une régulation différentielle dans les HMVEC mutées, mais aucun dans les ECFC mutées. Je me suis intéressée à 6 d’entre eux (LFNG, JAG2, TNFRSF1B, SLC6A6, SOX13 et CEBPG). Parmi eux, j’ai validé LFNG, codant pour lunatic fringe, un modulateur de la voie de signalisation Notch, dans les cellules HMEVCs, ECFCs et HUVECs (CE de la veine ombilicale de nouveau-nés isolées de couples HHT) mutées pour ALK1.Ce travail a révélé que l'hétérozygotie ALK1 n'altère pas l'activation de Smad1/5 ni n'affecte fortement la réponse transcriptomique à BMP9 ou BMP10. Une analyse bioinformatique plus approfondie a cependant mis en évidence quelques gènes avec une régulation altérée dans les cellules de nouveau-nés, ce qui indique que les changements observés dans les HMVEC mutées ne sont probablement pas uniquement dus à l'hétérozygotie d’ALK1, mais pourrait impliquer d’autres facteurs (mutation somatique/inflammation/angiogenèse). En conclusion, ces résultats remettent en question le modèle d'haploinsuffisance pour HHT et l'HTAP, et favorisent l'idée qu’un second facteur pourrait être nécessaire pour conduire à la pathogenèse vasculaire, tout en mettant en évidence quelques cibles thérapeutiques potentielles qui pourraient être très sensibles à la réduction des niveaux fonctionnels d'ALK1 et pourraient agir en tant qu'événements déclencheurs pour l'apparition précoce de la maladie.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04368499 , version 1 (01-01-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04368499 , version 1

Citer

Tala Al Tabosh. Transcriptomic characterization of endothelial cells from HHT and PAH patients carrying ALK1 mutations to propose new therapeutic approaches for these two vascular diseases. Cellular Biology. Université Grenoble Alpes [2020-..], 2023. English. ⟨NNT : 2023GRALV040⟩. ⟨tel-04368499⟩
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