Study of transposition modalities for bacterial insertion sequences of the IS91-ISCR families
Étude des modalités de transposition des séquences d'insertion bactériennes des familles IS91-ISCR
Résumé
The IS91/ISCR family is highly associated with virulence and antibiotic resistance genes. This atypical IS family encodes a HUH transposase mediating transposition events using a rolling circle transposition mechanism. Unlike the other members of the family, IS91 contains a small ORF potentially encoding a 121 amino acid polypeptide, Orf121, upstream of the transposase gene, tnpA. The first part of this work consisted of an in silico study of two members of the IS91 family, IS91 and IS1294b, that have conserved sequences of the transposase and terIS and oriIS regions. The second part of this work was experimental and focused on the transposition efficiency and regulation. We have shown that i) transcription of the tnpA gene originates mainly from the Porf121 promoter and that transcription of the two genes is coupled, ii) expression of the Orf121 protein in cis or in trans has an inhibitory effect on in vivo transposition of IS91, iii) Orf121 is required for recognition and precise cleavage of the terIS91 end to limit mobilization of the adjacent DNA. With regard to IS91 transposition, we showed that only single-stranded circular DNA intermediates can be inserted into a new target sequence and identified two zinc fingers essential for the transposase activity, called ZF1 involving cysteines 41, 68, 73 and 76 and ZF2 involving cysteines 53, 58, 360 and 363. Finally, we demonstrated that transposases from the IS91 family (IS91, ISKnp22) and the ISCR family (ISCR1) are able to mobilize and recognize and cleave the oriIS end of IS91, ISCR1 and ISCR2 and the terIS end of IS91 and ISCR2.
Les éléments de la famille IS91/ISCR constituent une famille hautement associée à des gènes de virulence et de résistance aux antibiotiques. Cette famille d'IS atypique code une transposase HUH médiant les évènements de transposition en utilisant un mécanisme de transposition en cercle roulant. Contrairement aux autres membres de la famille, IS91 contient un petit ORF codant potentiellement pour un polypeptide de 121 acides aminés, Orf121, en amont du gène de la transposase, tnpA. La première partie de ce travail a consisté à une étude in silico de deux éléments de la famille IS91, IS91 et IS1294b présentent des séquences conservées au niveau de la transposase et des régions terIS et oriIS. La deuxième partie du travail a été expérimentale concernant la régulation et l’efficacité de la transposition. Nous avons montré que i) la transcription du gène tnpA provient principalement du promoteur Porf121 et que la transcription des deux gènes est couplée, ii) l'expression de la protéine Orf121 en cis ou en trans a un effet inhibiteur sur la transposition in vivo de IS91, iii) Orf121 est nécessaire à la reconnaissance et au clivage précis de l'extrémité terIS91 pour limiter la mobilisation de l’ADN adjacent. En ce qui concerne la transposition de IS91, nous avons montré que seuls les intermédiaires circulaires ADN simple brin peuvent être insérés dans une nouvelle séquence cible et avons identifié deux doigts de zinc essentiels pour l’activité de la transposition, appelés ZF1 impliquant les cystéines 41, 68, 73, 76 et ZF2 impliquant les cystéines, 53, 58, 360 et 363. Enfin, nous avons démontré que les transposases des éléments de la famille IS91 (IS91, ISKnp22) et de la famille ISCR (ISCR1) sont capables de se mobiliser et de reconnaitre et cliver l’extrémité oriIS de IS91, ISCR1 et ISCR2 et l’extrémité terIS de IS91 et ISCR2.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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