Molecular and functional characterisation of the AAA-ATPase protein PbRpt3 of Plasmodium berghei : study of its PP1c regulatory function and analysis of its interaction network in the parasite
Caractérisation moléculaire et fonctionnelle de la protéine AAA-ATPase PbRpt3 de Plasmodium berghei : étude de sa fonction régulatrice de PP1c et analyse de son réseau d'interactions chez le parasite
Résumé
Malaria, caused by the Plasmodium parasite, is the most lethal parasitosis in the world, with more than 600,000 deaths in 2021, and mostly affects children under the age of 5, mainly in Africa. The RTS,S/A01 vaccine against this infectious disease has been recommended by the WHO since 2021. However, its relative efficacy, combined with the parasite's resistance to artemisinin-based chemo-therapeutic combinations (Artemisinin Combined Therapies) and the vector's resistance to insecticides, implies that further research is needed to gain a better understanding of the parasite's biology and design new anti-parasitic molecules. Reversible protein phosphorylation plays a crucial role in the development of the parasite. For example, it has recently been shown that the serine/threonine phosphatase PP1 is essential during the late stages of schizogony, particularly during the egress phase of the red blood cell. Our team studies the regulators of the catalytic subunit of the phosphatase (PP1c). Two PP1c interactome studies in Plasmodium berghei, have led our team to observe a potential interaction between PP1c and various proteins belonging to the parasite proteasome, including the AAA-ATPase PbRpt3 (PBANKA_0715600), which possesses two RVxF motifs, described as being predominantly present in proteins interacting with PP1c. Furthermore, using global approaches, Rpt3 was predicted to be essential in P. falciparum, whereas in P. berghei parasites deficient for this ATPase show a slow phenotype. The 26S proteasome is a protein complex involved in protein degradation, contributing to homeostasis and the stress response in eukaryotic cells. It is composed of a 20S complex carrying the catalytic activity, associated with one or two 19S regulatory complexes composed of ATPase (Rpt) and non-ATPase (Rpn) proteins. The PbRpt3 protein is thought to belong to the 19S complex of the parasite proteasome. During my thesis, I characterised the PbRpt3 regulatory subunit, demonstrated that it interacts with PP1c in vitro, and that it activates the phosphatase function of PP1c both in vitro and in a heterologous model of Xenopus oocytes. Using a site-directed mutagenesis approach, we observed that the RVxF motifs of PbRpt3 were involved in its binding to PP1c, and in the regulatory function towards this phosphatase. We built a 3D model of the PbRpt3 protein by comparative homology, which enabled us to predict the amino acids involved in ATP stabilisation. The mutation of these amino acids, combined with the Xenopus oocyte approach, led us to show that the enzymatic activity of PbRpt3 would be involved in the activation of the PP1c phosphatase. Using reverse genetics studies, we suggest an essential role for Rpt3 during the intra-erythrocytic stages in P. berghei, as no PbRpt3-deficient parasites were obtained in mice despite numerous cloning attempts and the use of the PlasmoGem system. A Knock-in approach, using the mCherry tag, enabled the protein to be located during the intra-erythrocytic cycle, showing a presence in the cytoplasm during the trophozoite to schizont stages, and a localised concentration in the nucleus in gametocytes. Finally, immunoprecipitation followed by mass spectrometry analysis enabled us to characterise the PbRpt3 interactome in the parasite during the schizont stage. We confirmed that PbRpt3 belongs to the 19S proteasome complex and observed that this ATPase associates with several proteins known to bind to membrane phospholipids. These observations suggest that PbRpt3 could play a direct role, or indirect, through interacting with partners, in the membrane dynamics of P. berghei.
Le paludisme, causé par le parasite Plasmodium est la parasitose la plus létale au monde, avec plus de 600 000 décès en 2021, et touche en grande majorité des enfants de moins de 5 ans principalement en Afrique. Contre cette maladie infectieuse, le vaccin RTS,S/A01 est recommandé depuis 2021 par l'OMS. Néanmoins, son efficacité relative, associée aux résistances apparues chez le parasite contre les combinaisons chimio-thérapeutiques à base d'artémisinine (Artemisinin Combined Therapies) et aux résistances du vecteur aux insecticides, engendrent la nécessité de poursuivre les efforts de recherche pour mieux comprendre la biologie du parasite et concevoir de nouvelles molécules anti-parasitaires. La phosphorylation réversible des protéines joue un rôle crucial lors du développement du parasite. Ainsi, il a récemment été démontré que la sérine/thréonine phosphatase PP1 était essentielle lors des stades tardifs de la schizogonie, notamment lors de la phase de sortie (« egress ») du globule rouge. Notre équipe étudie les régulateurs de la sous-unité catalytique de la phosphatase (PP1c). Au cours de deux études d'interactome de PP1c chez Plasmodium berghei, notre équipe a observé une interaction potentielle entre PP1c et différentes protéines du protéasome parasitaire, dont l'AAA-ATPase PbRpt3 (PBANKA_0715600). Cette protéine possède deux motifs RVxF, décrits pour être majoritairement présents chez les protéines interagissant avec PP1c. De plus, grâce à des approches globales, Rpt3 a été prédite comme essentielle chez P. falciparum, alors que chez P. berghei les parasites déficients pour cette ATPase présentent un phénotype lent. Le protéasome 26S est un complexe protéique impliqué dans la dégradation des protéines, contribuant à l'homéostasie et à la réponse au stress des cellules eucaryotes. Il est composé d'un complexe 20S portant l'activité catalytique, associé à un ou deux complexes régulateurs 19S composé de protéines ATPases (Rpt) et non-ATPases (Rpn). La protéine PbRpt3 appartiendrait au complexe 19S du protéasome parasitaire. Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé la sous-unité régulatrice PbRpt3, démontré qu'elle interagissait avec PP1c in vitro, et qu'elle activait la fonction phosphatase de PP1c à la fois in vitro et dans un modèle hétérologue d'ovocytes de Xénope. Par une approche de mutagenèse dirigée, nous avons observé que les motifs RVxF de PbRpt3 étaient impliqués dans sa fonction de liaison et de régulation de PP1c. Nous avons construit un modèle 3D de la protéine PbRpt3 par homologie comparative, ce qui nous a permis de prédire les acides aminés intervenant dans la stabilisation de l'ATP. La mutation de ces acides aminés, combinée à l'approche en ovocytes de Xénope a conduit à montrer que l'activité enzymatique de PbRpt3 serait impliquée dans sa fonction d'activation de la phosphatase PP1c. Grâce à des études de génétique inverse, nous suggérons un rôle essentiel de Rpt3 lors des stades intra-érythrocytaires chez P. berghei car aucune lignée de parasites déficients pour PbRpt3 n'a été obtenue chez la souris malgré de nombreuses tentatives de clonage et l'utilisation du système PlasmoGem. Une approche de Knock-in, en utilisant le tag mCherry a permis de localiser la protéine au cours du cycle intra-érythrocytaire, avec une présence dans le cytoplasme lors des stades trophozoïte à schizonte, et une concentration localisée dans le noyau chez les gamétocytes. Enfin, des immunoprécipitations suivies d'une analyse en spectrométrie de masse ont permis de caractériser l'interactome de PbRpt3 chez le parasite au stade schizonte. Ainsi, nous avons confirmé que PbRpt3 appartiendrait au complexe protéasome 19S, et observé que cette ATPase s'associe à plusieurs protéines connues pour lier les phospholipides membranaires. Ces observations suggèrent que PbRpt3 pourrait jouer un rôle direct, ou via ses partenaires, dans la dynamique des membranes chez P. berghei.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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