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Thèse Année : 2023

Epigenetic regulation of gene expression by RNA modifications in Drosophila

Régulation épigénétique des ARNs par méthylation chez la drosophile

Giulia Franco
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1341420
  • IdRef : 270515151

Résumé

A huge number of epigenetic modifications occur on eukaryotic messenger RNAs such as the addition of a 5′ cap, a polyA tail or of internal marks including the methylation of adenosine ring at position 6 (m6A). These modifications tightly regulate mRNAs stability and translational activity, therefore providing crucial additional levels of gene expression regulation.The first chapter of my thesis focuses on the study of the PCIF1 protein using Drosophila melanogaster as a model. PCIF1 is a RNA cap-specific m6A methyltransferase that binds to RNA polymerase II (RNA Pol II) and deposits a methyl group on the adenosine ring if the first transcribed nucleotide is an adenosine (m6Am). In knock-out mice, the lack of PCIF1 results in reduced body weight and deregulation of a pool of genes in several tissues, particularly in testis. In Drosophila, Pcif1 is conserved but a single amino acid substitution inactivates the methyltransferase activity. I used CRISPR-Cas9 to create Pcif1 Drosophila mutants and performed their phenotypic and molecular analysis in order to determine the non-catalytic functions of Pcif1. I showed that Pcif1 mutants displayed reduced fertility. Moreover, RNA sequencing revealed a set of dysregulated genes in Pcif1 mutant ovaries indicating a role in gene expression regulation. I also observed that reduced Pcif1 dosage in heterozygous flies induced a suppression of the white gene silencing due to the position-effect variegation (PEV), in which the euchromatic white gene is translocated near the heterochromatin rendering it sensitive to slight modifications of gene expression regulation. Finally, experiments performed by our collaborators in Pr. E. Brasset laboratory revealed that Pcif1 binds to euchromatin at interphasic chromosomal bands, indicating that it is associated with actively transcribed genes. Taken together, our results suggest that despite the lack of catalytic activity, Pcif1 is involved in gene expression regulation, putatively acting as a scaffolding protein recruited in the RNA Pol II complex, a hypothesis reinforced by the fact that Pcif1 is known to bind to the C-term of Pol II.The second chapter of my thesis is centred on the identification of alternative RNA cap structures and decapping enzymes that ensure both the degradation of mRNA and their recycling into nucleotides, in Drosophila. The canonical cap is defined as the N7-methylguanine (m7G-cap) that is attached to the first transcribed nucleotide of eukaryotic mRNAs and hydrolysed by the conserved DCP2 decapping enzyme. DCP2 belongs to a large family of evolutionary conserved hydrolases, Nudix, which consists of 22 members in mammals that all share the ability to hydrolyse different metabolite substrates. In addition, several alternative cap structures have been identified so far in various bacteria or eukaryotes such as: nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), flavine dinucleotide (FAD), diphospho-coenzymeA (dpCoA) and diadenosine-tetraphosphate (Ap4A), uridine diphosphate glucose (UDP-Glc), and uridine diphosphate N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc). Since little is known about the role of the Nudix family members and the putative presence of alternative cap structures in higher eukaryotes, my goal was to perform a functional analysis of the Nudix family in Drosophila. By using an RNAi-based genetic screen approach, I induced the silencing of each of the 12 Nudix genes in a tissue specific manner in Drosophila. My work pointed out that the closely related Nudix proteins Nudt19A and Nudt19B are required for full fly fertility. These proteins are predicted to hydrolyse Coenzyme A but nothing is known about their putative decapping activity. We generated CRISPR/Cas9 mutants of Nudt19A and Nudt19B, in order to further investigate their specific function in fly fertility and potential role in mRNA decapping in eukaryotes.
Un grand nombre de modifications épigénétiques ciblent les ARN messagers eucaryotes comme l’ajout d’une coiffe 5', d’une queue polyA ou de marques internes telles que la méthylation du cycle adénosine en position 6 (m6A). Ces modifications régulent la stabilité et l'activité traductionnelle des ARNm et constituent des niveaux essentiels de régulation de l'expression génique chez les eucaryotes.Le premier chapitre de ma thèse porte sur l'étude de l’ARN méthyltransférase PCIF1 chez la mouche Drosophila melanogaster. PCIF1 se lie à l’ARN polymerase II (ARN Pol II) et dépose un groupe méthyl sur le cycle adénosine (m6Am) si le premier nucléotide transcrit est une adénosine. Chez la souris, l'absence de PCIF1 entraîne une perte de poids et une dérégulation de nombreux gènes dans plusieurs tissus, notamment dans le testicule. Chez la drosophile, Pcif1 est conservée mais une substitution d'un seul acide aminé inactive l'activité méthyltransférase. J'ai analysé les conséquences phénotypiques et moléculaires de mutants Pcif1générés par la méthodologie CRISPR/Cas9 afin de déterminer les fonctions indépendantes de l’activité catalytique de Pcif1 chez la drosophile. J'ai montré que les mutants Pcif1 mâles et femelles présentaient une fertilité réduite. De plus, le séquençage des ARNm a révélé un ensemble de gènes dérégulés dans les ovaires mutants. J'ai également observé une suppression de la bigarrure de l’œil induite par effet de position (PEV) chez les hétérozygotes Pcif1/+ qui témoigne d’un effet sur l’expression du gène white. Des expériences complémentaires réalisées au sein du laboratoire du Pr. E. Brasset ont révélé que Pcif1 se lie à l'euchromatine au niveau des bandes chromosomiques interphasiques correspondant aux gènes activement transcrits. L'ensemble de nos résultats montrent que malgré l'absence d'activité catalytique, Pcif1 est impliquée dans la régulation de l'expression génique chez la drosophile. Pcif1 pourrait agir comme modulateur au sein du complexe transcriptionnel, une hypothèse renforcée par le fait que Pcif1 se lie directement à la partie C-terminale de l’ARN Pol II.Le deuxième chapitre de ma thèse est centré sur l'identification de structures alternatives de la coiffe et d'enzymes capables de les hydrolyser, conduisant à la dégradation des ARNm et au recyclage des nucléotides. La coiffe canonique consiste en une N7-méthylguanine (m7G-cap) qui est attachée au premier nucléotide transcrit des ARNm eucaryotes ; elle est hydrolysée par DCP2. DCP2 appartient à une grande famille d'hydrolases conservées au cours de l'évolution, la famille Nudix, qui comprend 22 membres chez les mammifères. Plusieurs structures de coiffe alternatives ont été identifiées chez des bactéries ou divers eucaryotes, telles que : le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), la flavine dinucléotide (FAD), le diphospho-coenzymeA (dpCoA) et le diadénosine-tétraphosphate (Ap4A), l’uridine diphosphate glucose (UDP-Glc) et l’uridine diphosphate N-acétylglucosamine (UDP-GlcNAc). Peu de données existent sur le rôle des membres de la famille Nudix et l’existence ou non de coiffes alternatives chez les eucaryotes supérieurs. Dans ce contexte, mon objectif était d'effectuer une analyse fonctionnelle de la famille Nudix chez la drosophile. En utilisant une approche de criblage génétique reposant sur l'expression d’ARN interférents de façon ciblée dans différents tissus, j'ai induit l’extinction de chacun des 12 gènes Nudix chez la drosophile. Mes travaux ont mis en évidence que les deux protéines Nudt19A et Nudt19B sont nécessaires à la fertilité normale des mouches. D’après leur séquence, ces protéines, qui sont étroitement apparentées, sont des hydrolases du Coenzyme A, une activité qui reste à confirmer expérimentalement. Nous avons généré des mutants CRISPR/Cas9 des deux gènes Nudt19A et Nudt19B, afin d'étudier plus en détail leur fonction dans la fertilité et leur rôle potentiel dans l’hydrolyse d’une coiffe alternative chez les eucarytes.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04416300 , version 1 (25-01-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04416300 , version 1

Citer

Giulia Franco. Epigenetic regulation of gene expression by RNA modifications in Drosophila. Biochemistry [q-bio.BM]. Université Grenoble Alpes [2020-..], 2023. English. ⟨NNT : 2023GRALV017⟩. ⟨tel-04416300⟩
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