Vinculin-Arp2/3 interaction antagonises branched actin to control single and collective cell behaviours - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2023

Vinculin-Arp2/3 interaction antagonises branched actin to control single and collective cell behaviours

L’interaction Vinculin-Arp2/3 antagonise l’actine branchée pour contrôler les comportements cellulaires individuels et collectifs

John James
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1353524
  • IdRef : 27583834X

Résumé

Development, growth and maintenance of tissues are emergent properties arising from individual cell behaviour. Cell behaviour is finely tuned by a multitude of regulatory pathways in response to stimuli received from their microenvironment. Physical forces are sensed at cell-substrate contacts called focal adhesions (FAs) and cell-cell contacts called adherens junctions (AJs) which connect the exterior of a cell to its actin cytoskeleton. In response to force sensing, the actin cytoskeleton is remodelled to regulate complex cell behaviours such as proliferation, migration and cell-junction maintenance that are under the control of branched actin. During cancer progression, these three processes are deregulated. Vinculin (VCL), described as a tumour suppressor, is a structural and mechanotransductory protein present in both FAs and AJs. In addition to reinforcing the link between the actin cytoskeleton and adhesive structures, VCL is likely to plays a second regulatory role on the actin cytoskeleton by interacting with the branched actin nucleator Arp2/3. The goal of this project was to determine the effects of VCL on branched actin, and ultimately cell behaviour. To this end, we used CRISPR-Cas9 genome editing techniques to perturb this interaction.We began studying the effects of the interaction on individual cell behaviour by expressing a VCL 811-881 peptide in Parental MCF10A cells. We found that the peptide binds the canonical Arp2/3 complex, and cells expressing the peptide are able to migrate more persistently, spread over a larger area, make larger lamellipodia and continue to proliferate at high cell densities. All these phenotypes indicate that Arp2/3 activity is increased in these cells. VCL knockout (VCL-/-) cell lines and a mutant cell line where VCL cannot bind Arp2/3 (VCL P878A-KI) both behave similarly. TIRF-SIM imaging revealed that the actin network assembly rate was increased in VCL-/-, VCL P878A-KI and VCL 811-881 expressing cells compared to Parental MCF10A. Together, this demonstrates that the function of the VCL-Arp2/3 interaction is to antagonize generation of branched actin networks in the lamellipodium, and that the VCL 811-881 peptide acts as a dominant negative of VCL function.To understand the role of the VCL-Arp2/3 interaction on collective cell behaviour, we first studied AJs which not only hold cells together but also allow them to pass on mechanical signals. We found that the VCL controls Arp2/3 recruitment to AJs and cell-cell junction stability. Once AJs were mature, Parental MCF10A cells were able to organise long-range transcellular actin networks coordinated across multiple cells. During hypotonic unjamming, these cells migrate collectively as domains constrained by the long-range actin network. VCL P878A cells are not constrained by any long-range transcellular actin network and migrate more collectively while VCL-/- cells develop a very short-range actin network leading to reduced collective migration. Our results indicate that Arp2/3 activity has to be finely regulated at AJs by VCL to form this long range network and regulate collective migration.Thus, we have established as a novel role for VCL in regulating the actin cytoskeleton through a direct interaction that antagonizes Arp2/3. Perturbation of this interaction leads to several phenotypes characteristic of cancer cells – increased proliferation, increased persistence of migration, perturbation of cell junctions and misregulation of collective migration. Since Arp2/3 activity is known to be upregulated in several cancer types, our results provide a potential mechanism for vinculin’s role as a tumour suppressor.
Le développement, la croissance et le maintien des tissus sont des propriétés découlant du comportement individuel des cellules. Ce comportement est finement contrôlé par de multiples voies de régulation en réponse aux stimuli environnementaux. Les forces sont détectées au niveau des adhésions focales (FAs), et des jonctions adhérentes (AJs), des structures d’adhérence qui relient l'environnement d'une cellule à son cytosquelette d'actine. En réponse à ces forces, le cytosquelette est remodelé et régule des comportements cellulaires complexes comme la prolifération, migration et maintien des jonctions cellulaires sous le contrôle de l’actine branchée. Ces processus sont dérégulés durant la progression des cancers. La vinculine (VCL), décrite comme suppresseur de tumeur, est une protéine structurale et mécanotransductrice aux FAs et les AJs. En plus de renforcer le lien entre le cytosquelette d'actine et les structures d’adhérence, VCL pourrait jouer un rôle dans la régulation du cytosquelette d'actine en interagissant avec Arp2/3, le nucléateur d'actine branchée. Le but de ce projet était de déterminer les effets de VCL sur l’actine branchée et le comportement des cellules. Pour cela, nous avons utilisé des techniques d'édition du génome afin de perturber cette interaction.Nous avons étudié les effets de l’interaction VCL-Arp2/3 sur le comportement cellulaire individuel en exprimant un peptide VCL 811-881 dans les cellules parentales MCF10A. Nous avons constaté que ce peptide se lie au complexe Arp2/3 canonique, et que les cellules l’exprimant sont capables de migrer de manière plus persistante, de s'étendre sur une plus grande surface, de former des lamellipodes plus grands et de continuer à proliférer à de fortes densités cellulaires. Ces phénotypes indiquent une activité d'Arp2/3 augmentée. On retrouve ces phénotypes avec des lignées cellulaires KO de VCL (VCL-/-) et une lignée cellulaire mutante dans laquelle VCL ne se lie pas à Arp2/3 (VCL P878A-KI). L'imagerie TIRF-SIM a révélé que la vitesse d'assemblage du réseau d'actine est augmentée dans les cellules VCL-/-, VCL P878A-KI ou exprimant le peptide VCL 811-881 par rapport aux cellules parentales MCF10A. Ensemble, ces résultats démontrent que l’interaction VCL-Arp2/3 antagonise la formation des réseaux d’actine branchée dans le lamellipode, et que VCL 811-881 agit comme un dominant négatif de VCL.Pour comprendre le rôle de l'interaction VCL-Arp2/3 sur les comportements cellulaires collectifs, nous avons d'abord étudié les AJs qui maintiennent les cellules ensemble et leur permettent de transmettre des signaux mécaniques. Nous avons trouvé que VCL contrôle le recrutement d’Arp2/3 aux AJs et la stabilité des jonctions cellule-cellule. Une fois les AJs matures, les cellules parentales MCF10A peuvent organiser des réseaux d'actine transcellulaires sur de longues distances et coordonnés entre plusieurs cellules. En condition d’unjamming hypotonique, ces cellules migrent collectivement au sein de domaines restreints par ce réseau d'actine transcellulaire. Les cellules VCL P878A ne développent pas ce réseau et migrent de manière plus collective, alors que les cellules VCL-/- migrent moins collectivement et développent un réseau à très courte distance. Nos résultats indiquent donc que l'activité d'Arp2/3 doit être finement régulée aux AJs pour former ce réseau et contrôler les migrations collectives des cellules.Ainsi, nous montrons un nouveau rôle pour VCL dans la régulation de l'actine branchée par son interaction directe qui antagonise Arp2/3. La perturbation de cette interaction entraîne plusieurs phénotypes caractéristiques des cellules cancéreuses : une prolifération et persistance de migration accrue, une perturbation des jonctions cellulaires et une dérégulation des migrations collectives. Étant donné que l'activité d'Arp2/3 est surexprimée dans plusieurs types de cancer, nos résultats expliquent comment VCL pourrait agir comme suppresseur de tumeur.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04462783 , version 1 (16-02-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04462783 , version 1

Citer

John James. Vinculin-Arp2/3 interaction antagonises branched actin to control single and collective cell behaviours. Biochemistry, Molecular Biology. Institut Polytechnique de Paris, 2023. English. ⟨NNT : 2023IPPAX064⟩. ⟨tel-04462783⟩
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